Основной
Библиографический список
Работа 65. Оценка биосинтетической функции ткани по соотношению РНК и ДНК к белку
Исследуемый материал: ткани крысы.
Реактивы: 0,3 М, 0,5 М, 0,6 М растворы HСlO4; 0,6 М раствор КОН, биуретовый реактив (см. работу 59).
Оборудование: пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, спектрофотометр, кипящая водяная и ледяная бани, центрифуга, фильтровальная бумага, стеклянная палочка, пробки для пробирок с обратным холодильником.
ХОД РАБОТЫ. Определение проводят строго на холоде в центрифужных пробирках, ставя 4-5 параллельных проб.
К 0,1 мл гомогената добавляют 1,9 мл 0,3 М раствора HСlO4. Для полноты осаждения кислотонерастворимой фракции пробирки на 15 мин помещают в лед. Затем центрифугируют при 3000 g 10-15 мин. Осадки дважды отмывают 0,2 М раствором HСlO4. После последнего центрифугирования стенки пробирки тщательно подсушивают фильтровальной бумагой, чтобы избежать загрязнения фракции кислотонерастворимым материалом, имеющимся в надосадочной жидкости.
Осадки суспендируют, предварительно растерев стеклянной палочкой в 0,5 мл воды, затем добавляют при комнатной температуре 0,5 мл 0,6 М раствора КОН, суспензия при этом светлеет. Если осадок суспендировать непосредственно в 0,3 М растворе КОН, быстро образуется желатиноподобный осадок, который не растворяется даже после гидролиза в течение 1 ч при 37˚С. Через 1 ч инкубации при 37˚С пробирки переносят на лед для остановки гидролиза.
В каждую пробирку добавляют по 2 мл 0,6 М раствора HСlO4 и оставляют на 15 мин на льду. Центрифугируют 10 мин при 3000 g. Надосадочную жидкость параллельных проб объединяют для определения содержания РНК и измеряют поглощение в ультрафиолетовом свете при 270 нм и 290 нм. Стенки пробирок тщательно подсушивают, так как в осадке в дальнейшем определяют ДНК.
D270 – D290
Количество РНК (мкг/мл надосадочной жидкости) = ––––––––––– • 10,5.
0,19
Подсушенные пробирки с осадками заливают 0,5 М раствором HСlO4 по 3 мл на пробу. Гидролиз проводят с каплеуловителем (во избежание изменения объема) на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Для расчета используют формулу:
D270 – D290
Количество ДНК (мкг/мл надосадочной жидкости) = ––––––––––– • 10,1.
0,19
Белок в ткани определяют биуретовым методом (см. работу 58). Соотношение РНК/белок и ДНК/белок оценивают в мкг/г ткани. Делают вывод о биосинтетической функции различных тканей.
1. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. - 3-е изд-е, перераб. и доп. - М.: Медицина, 1998.- 704 с.
2. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. -2-е изд-е, перераб. и доп. - М.: Высш.шк.,1998.- 479 с.
3. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рём – М.: Мир, 2000. – 469 с.
4. Марри, Р. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Радуэлл. В 2-х т. Пер. с англ. - М.: Мир, 1993.
5. Николаев, А.Я. Биологическая химия: Учебник / А.Я. Николаев. – 3-е изд.. перераб. и доп. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – 568 с.: ил.
6. Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер. В 3-х т.- М.: Мир, 1983.
7. Страйер, Л. Биохимия / Л. Страйер. В 3-х т. - М.: Мир, 1984.
8. Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филиппович - 4-е изд-е, перераб. и доп. - М.: Изд-во “Агар”, 1999. - 512 с.