Работа 64. Переаминирование аминокислот
Переаминирование (трансаминирование) – перенос аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту с образованием новой аминокислоты и новой кетокислоты. О трансаминировании можно судить по убыли субстратов реакции либо по нарастанию конечных продуктов реакции. Для разделения и последующего количественного определения глутаминовой кислоты и α-аланина можно использовать метод хроматографии. Реакцию переаминирования следует проводить в присутствии монойодуксусной кислоты для предотвращения перехода пирувата в лактат.
Исследуемый материал: печень крысы.
Реактивы: эфир, 0,1%-ный раствор КНСО3, 0,08 М раствор СН3СООН, глутаминовая кислота, пируват, монойодуксусная кислота, дистиллированная вода, аланин, бутанол, ледяная уксусная кислота, 1%-ный раствор нингидрина в ацетоне.
Оборудование: ножницы, эксикатор, ледяная баня, хроматографическая камера, пробирки, пипетки, термостат, хроматографическая бумага, фильтры, фрфоровая чашка, пестик, марля, водяная баня, пробки, плита.
ХОД РАБОТЫ. Печень крысы размельчают на холоде в фарфоровой ступке, с пятикратным объемом 0,1%-го раствора КНСО3. Полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя марли.
Готовят 5 проб с реакционной средой, состав которых указан в таблице.
| № | Глутаминовая кислота | Пируват, | Монойод уксусная кислота | КНСО3 | Н2О | Гомогенат | Аланин |
| 1 мл | 1 мл | 0,5 мл | - | - | 1 мл | - | |
| 1 мл | 1 мл | 0,5 мл | - | - | 1 мл | - | |
| - | 1 мл | 0,5 мл | 1 мл | - | 1 мл | - | |
| 1 мл | - | - | - | 4 мл | - | - | |
| - | - | - | - | 4 мл | - | 1 мл |
Последние две пробы являются свидетелями для идентификации хроматографических пятен.
Пробу №1 после добавления гомогената нагревают до кипения в течение 10 мин на кипящей водяной бане, а затем добавляют 1,5 мл 0,08 М раствора СН3СООН для полного осаждения тканевых белков, перемешивают и после охлаждения пропускают через бумажный фильтр. Эта проба необходима для определения исходной концентрации субстратов реакции.
Пробы №2 и №3 после перемешивания закрывают пробками и подвергают инкубации в термостате при 37ºС. Инкубацию проводят 60 мин при периодическом встряхивании. По окончании инкубации пробы №2 и №3 обрабатывают так же, как и пробу №1.
Пробы №4, №5 сразу после приготовления наносят на хроматографическую бумагу и отмечают как свидетелей карандашом.
Метод бумажной хроматографии. Метод хроматографии на бумаге относится к распределительной хроматографии и основан на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях, одна из которых удерживается бумагой, а другая является подвижной. При бумажной хроматографии в качестве носителя применяется целлюлоза в виде особой фильтровальной бумаги. Скорость движения аминокислот определяется характерной для данного вещества в данной системе растворителей величиной коэффициента распределения.
Концентрация в водной фазе
а = –––––––––––––––––––––––––
Концентрация в подвижной фазе.
Следовательно, относительное расположение анализируемых веществ на хроматограмме для данной системы растворителей постоянно и характеризуется величиной коэффициента скорости движения:
Расстояние от анализируемого вещества до старта
Rf = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Расстояние фронта растворителя от старта
Величина Rf для данной подвижной системы является постоянной, однако она зависит от качества бумаги, постоянства температуры, степени чистоты, растворителей, однотипности процедур и аппаратуры.
Приготовление растворителя. В мерном цилиндре смешивают 40 мл бутанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл дистиллированной воды. Смесь встряхивают в течение 1-2 мин.
Проведение хроматографии. Берут лист хроматографической бумаги и на расстоянии 3 см от его короткого края проводят простым карандашом горизонтальную линию, которую делят на 5 отрезков. Каждое пересечение нумеруют. На линию старта наносят приготовленные пробы. Нанесение проводят в несколько приемов, следя за тем, чтобы пятно раствора при каждом прикосновении пипетки к бумаге не растекалось более, чем на 3 мм. Каждую следующую порцию раствора из пипетки наносят после полного высыхания предыдущей, что определяют по исчезновению просвечивания бумаги в точке нанесения. В точки наносят по 50 мкл – порциями по 5 мкл полученной пробы.
Хроматограмму устанавливают в хроматографическую камеру, на дно которой наливают 50 мл разделительной смеси. Хроматографическую камеру хорошо закрывают, чтобы исключить возможность испарения компонентов подвижной фазы. Разделение ведут до тех пор, пока линия фронта растворителя не приблизится к краю бумаги (не доходя до края 2-3 см). Поле этого хроматограмму вынимают из камеры и, держа пинцетом, высушивают над плитой для удаления из бумаги растворителя.
Высушенную хроматограмму протягивают через 1%-ный раствор нингидрина в ацетоне для обнаружения на ней пятен аминокислот. Затем хроматограмму высушивают для удаления ацетона. Аминокислоты стандартной и опытной проб обнаруживаются в виде сине-фиолетовых пятен.
Идентификация аминокислот. Идентификацию аминокислот, содержащихся в экстракте, ведут по совпадению на хроматограмме позиций, занимаемых аминокислотами стандартной и опытной проб, и величинам коэффициента движения Rf.
Величины Rf для аланина равна 0,28, для глутаминовой кислоты – 0,17.