Работа 61. Определение активности аргиназы печени

Фермент аргиназа (L-аргининуреогидролаза) катализирует реакцию расщепления аргинина с образованием орнитина и мочевины.

В печени человека и животных этой реакцией завершается синтез мочевины – главного конечного продукта обмена азота в организме.

Аргиназной активностью обладают и некоторые другие органы животных, а также ткани высших растений и некоторые бактерии. Это свидетельствует о том, что аргиназа является филогенетически древним ферментом. Роль аргиназы в других тканях и органах недостаточно изучена.

Определение активности аргиназы используется для диагностики некоторых заболеваний, например, печени. При усилении распада белков в тканях (голодание, аллоксановый диабет, авитаминоз В₁, введение кортикостероидов, тироксина и др.) повышается активность аргиназы в печени. Обнаружено также тяжелое наследственное заболевание, обусловленное недостаточностью этого фермента.

Удобным объектом для определения активности аргиназы служит гомогенат печени животных.

Активность аргиназы можно определить двумя способами:

1) определить количество продуктов реакции – мочевины или орнитина, образовавшихся за определенное время;

2) определить количество аргинина, оставшегося нерасщепленным после прекращения действия фермента.

В данной работе об активности аргиназы судят по образованию продукта реакции – мочевины. Концентрацию мочевины определяют колориметрическим методом. В основе метода лежит способность мочевины давать с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде комплексное соединение, окрашенное в красный цвет. Интенсивность окраски измеряется на ФЭКе.

 

Исследуемый материал:печень крысы.

Реактивы: 0,9%-ный раствор NaCl, 0,007 М раствор аргинина (рН 9,5), 5%-ный раствор ТХУ, фосфатный буфер (рН 9,5), реактивы для определения концентрации мочевины (см. работу 60).

Оборудование: пипетки, пробирки, термостат, ножницы, баня со льдом и водяная баня, ступка, пестик, воронка, фильтры, центрифуга, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, весы, разновесы.

 

ХОД РАБОТЫ. Приготовление гомогената печени. Печень только что убитой крысы извлекают и промывают холодным 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Навеску печени (1 г) измельчают ножницами на льду и гомогенизируют в 2 мл фосфатного буфера. Гомогенат разводят тем же буфером в соотношении 1:10 к навеске печени (например, если навеска 1 г, то объем гомогената должен быть 10 мл).Разведенный гомогенат фильтруют через 2 слоя марли.

Инкубация фермента с субстратом. В 2 пробирках (опытной и контрольной) готовят инкубационные смеси, как указано в таблице, соблюдая последовательность добавления реактивов.

 

Проба	Буфер, мл	Раствор аргинина, мл	ТХУ, мл	Гомогенат
Опытная	1,4	0,2	-	0,4
Контрольная	1,4	0,2		0,4

 

Пробы тщательно перемешивают и инкубируют в термостате при температуре 37ºС в течение 15 мин.

После окончания инкубации в опытную пробу для прекращения действия фермента добавляют 2 мл 5%-ной ТХУ и тщательно перемешивают. Обе пробы центрифугируют и в полученном фильтрате определяют концентрацию мочевины методом, описанным в предыдущей работе, и содержание белка биуретовым методом.

Рассчитывают удельную активность фермента. Для этого нужно знать содержание ткани и концентрацию белка в пробе.

 

Удельная активность фермента = х / t · m мкмоль / (мин·мг),

где х – содержание мочевины (мкмоль/мл), t – время инкубации пробы (мин), m - содержание белка пробе (мг).