Спектрофотометричекий метод

Метод Брэдфорд

Микробиуретовый метод

 

Исследуемый материал:стандартный раствор белка, содержащий 1 мг в 1 мл.

Реактивы: биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта) – 17,3 г цитрата натрия и 10 г Na₂CO₃ растворяют при подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл; 6%-ный раствор NaOH.

Оборудование:пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы

ХОД РАБОТЫ. К 2 мл раствора, содержащего 0,1-2,0 мг белка, добавляют 2 мл 6%-ного раствора NaOH и 0,2 мл раствора Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 530 нм на спектрофотометре. Предварительно строят график по стандартному раствору белка.

 

Метод основан на связывании с белками одного из кислых красителей кумасси синего. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется. Интенсивности окраски от концентрации белка в пробе в диапазоне 1-10 мкг/мл имеет линейную зависимость. Поскольку белки различаются по своей способности связывать красители, желательно строить калибровочный график с использованием того белка, концентрацию которого в дальнейшем предполагают определить.

 

Исследуемый материал:стандартный раствор белка, содержащий 0,05 мг/мл.

Реактивы: раствор красителя – 10 мг кумасси G-250 гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл 95%-ного спирта, полученный раствор смешивают с 10 мл 95%-ной фосфорной кислоты, разводят до конечного объема 100 мл. Отфильтрованный раствор красителя хранится около 2 недель.

Оборудование:пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы.

ХОД РАБОТЫ. 1,5 мл раствора, содержащего от 10 до 50 мкг белка, смешивают с 1,5 мл раствора красителя. Через 3-5 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм, используя в качестве контроля пробу, не содержащую белка. В описанной модификации А₅₉₅ линейно зависит от количества белка в интервале от 10 до 50 мкг.

 

 

Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине кюветы 1,0 см).

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов, поэтому измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм.

 

Исследуемый материал:стандартный раствор белка, содержащий 1-5 мг/мл.

Оборудование:пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы

Содержание белка находят по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм:

 

Содержание белка 1,45 · А₂₈₀ – 0,74 · А₂₆₀ (мг/мл)

Определить содержание белка в сыворотке крови разными методами. Полученные результаты сравнить.

 

Диагностическое значение. Увеличение белка в крови (гиперпротеинемия) наблюдается сравнительно редко. Относительная гиперпротеинемия наблюдается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости. Гипопротеинемия наблюдается при недостаточном поступлении белка с пищей, заболеваниях желудочно-кишечного тракта, понижении биосинтеза белка при хронических паренхиматозных гепатитах, интоксикациях, злокачественных новообразованиях. Гипопротеинеия может наблюдаться при потерях белка организмом при острых и хронических кровопотерях, увеличенной проницаемости капилляров, кровопусканиях.