Биуретовый метод

Работа 59. Количественное определение белка

РАЗДЕЛ 6. ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ

Контрольные вопросы

1. Биологические функции нуклеотидов и полинуклеотидов.

2. Строение нуклеотидов и полинуклеотидов.

3. Биосинтез пуриновых и пиримидиновых оснований.

4. Катаболизм пуриновых и пиримидиновых оснований.

5. Нарушение обмена пуриновых и пиримидиновых оснований.

 

Для количественного определения белков используют физические, химические и биологические методы.

Из физических методов простейшим является взвешивание чистого белка. Однако белки очень гигроскопичны, и полностью удалить из их состава воду очень трудно, поэтому этот способ применяют редко.

Наибольшее распространение из физических методов количественного определения белков получили три – рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок), пикнографический метод (по плотности белковых растворов).

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простой химический метод определения - количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от растворимых азотсодержащих веществ) азота.

Самым распространенным методом количественного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специфическим реагентом. Чтобы рассчитать концентрацию белка, строят калибровочный график.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности препарата, можно составить представление о содержании в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод не дает абсолютных результатов.

 

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

 

Исследуемый раствор:стандартный раствор белка, содержащий 10 мг в 1 мл.

Реактивы: биуретовый реактив – 0,15 г CuSO₄ 5H₂O и 0,6 г NaKC₄H₄O₆·4H₂O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ного раствора NaOH (свободного от Na₂CO₃), добавляют 0,1 г КI и доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке.

Оборудование:пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной светового пути 5 мм.

ХОД РАБОТЫ. В 4 сухие пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка. В три пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 2,5; 5,0; 7,5 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения калибровочной кривой. В 4-ю пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую необходимо определить.

В каждую пробирку добавляют по 2 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с длиной оптического пути 5 мм, пользуясь зеленым светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив.

Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.