Работа 52. Количественное определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови

Работа 51. Определение общих липидов в сыворотке крови

Общие липиды в крови представлены нейтральными жирами, свободными жирными кислотами, фосфолипидами, холестерином, липопротеинами различной плотности и являются показателями липидного обмена. Существую различные методы количественного определения общих липидов: колориметрические, нефелометрические.

 

Принцип метода. Продукты гидролиза ненасыщеных липидов образуют с фосфованилиновым реактивом соединение красного цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональны содержанию общих липидов.

 

Исследуемый материал: плазма и эритроциты кролика.

Реактивы: стандартный раствор липидов (8 г/л), концентрированная серная кислота, фосфованилиновый реактив.

Оборудование: пробирки, пипетки, водяная баня, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм.

 

ХОД РАБОТЫ. Производят гидролиз липидов, для этого в сухие пробирки приливают реактивы по схеме:

 

Реактивы (мл)	Опытная проба	Стандартная проба	Контроль
Сыворотка	0,02	-	-
Стандартный раствор	-	0,02	-
Серная кислота	1,50	1,50	1,50
Пробы перемешать и нагревать 15 мин в кипящей водяной бане. Затем охладить и гидролизат использовать для приготовления других проб
Гидролизат (для каждой пробы свой )	0,10	0,10	0,10
Фосфованилиновый реактив	1,50	1,50	1,50

 

Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 40 мин. Колориметрируют опытные и стандартную пробы против контроля при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,3 см. Расчет содержания общих липидов проводят по формуле

А = 8 Е_оп/Е_ст (г/л)

Нормальное содержание липидов – 4-8 г/л.

 

Клинико-диагностическое значение. Как физиологическое явление увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наступает через 1-4 часа после приема пищи. Концентрация липидов крови увеличивается при диабете (до 10-20 г/л), липоидном нефрозе, циррозе печени, ожирении, атеросклерозе, ишемической болезни сердца, гипотиреозе, панкреатите.

Большинство липидов находится в крови не в свободном состоянии, а в составе белково-липидных комплексов: хиломикронах, α-липопротеинах, β-липопротеинах. Липопротеины можно разделить различными методами: центрифугированием в солевых растворах различной плотности, электрофорезом, тонкослойной хроматографией. При ультрацентрифугировании выделяются хиломикроны и липопротеины разной плотности: высокой (ЛПВП – α-липопротеины), низкой (ЛПНП – β-липопротеины), очень низкой (ЛПОНП – пре-β-липопротеины) и др.

Фракции липопротеинов отличаются по количеству белка, относительной молекулярной массе липопротеинов и процентному содержанию отдельных липидных компонентов. Так, α-липопротеины, содержащие большое количество белка (50-60%), имеют более высокую относительную плотность (1,063-1,21), тогда как β-липопротеины и пре-β-липопротеины содержат меньше белка и значительное количество липидов – до 95% от всей относительной молекулярной массы и низкую относительную плотность (1,01-1,063).

 

Принцип метода. При взаимодействии ЛПНП сыворотки крови с гепариновым реактивом появляется мутность, интенсивность которой определяется фотометрически. Гепариновый реактив представляет собой смесь гепарина с хлоридом кальция.

 

Исследуемый материал: сыворотка крови.

Реактивы: 0,27%-ный раствор CaCl₂, 1%-ный раствор гепарина.

Оборудование: микропипетка, ФЭК, кювета с длиной оптического пути 5 мм, пробирки.

 

ХОД РАБОТЫ. В пробирку вносят 2 мл 0,27%-ного раствора СаCl₂ и 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора (Е₁) против 0.27%-ного раствора СаCl₂ в кюветах при красном светофильтре (630 нм). Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,04 мл 1%-ного раствора гепарина, перемешивают и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е₂) в тех же условиях.

Вычисляют разность оптической плотности и умножают ее на 1000 – коэффициент эмпирический, предложен Ледвиной, так как построение калибровочной кривой сопряжено с рядом трудностей. Ответ выражают в г/л.

 

х(г/л) = (Е₂ – Е₁) · 1000.

Клинико-диагностическое значение. Содержание ЛПНП (b-липопротеинов) в крови колеблется в зависимости от возраста, пола и составляет в норме 3,0-4,5 г/л. Увеличение концентрации ЛПНП наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, диабете, гликогенозах, ксантоматозе и ожирении, снижение – при b-плазмоцитоме. Среднее содержание холестерина в ЛПНП около 47%.

 

Работа 53. Определение общего холестерина в сыворотке крови, основанное на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька)

Холестерин экзогенный в количестве 0,3-0,5 г поступает с пищевыми продуктами, а эндогенный синтезируется в организме в количестве 0,8-2 г в сутки. Особенно много синтезируется холестерина в печени, почках, надпочечниках, артериальной стенке. Холестерин синтезируется из 18 молекул ацетил-СоА, 14 молекул NADPH, 18 молекул АТР.

При добавлении к сыворотке крови уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты жидкость окрашивается последовательно в красный, синий и наконец зеленый цвет. Реакция обусловлена образованием сульфокислоты холестерилена зеленого цвета.

 

Исследуемый материал: сыворотка крови.

Реактивы: реактив Либермана-Бурхарда (смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты в соотношении 1:5:1), стандартный (1,8 г/л) раствор холестерина.

Оборудование: сухие пробирки, сухие пипетки, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, термостат.

 

ХОД РАБОТЫ. Все пробирки, пипетки, кюветы должны быть сухими. Работать с реактивом Либермана-Бурхарда нужно очень осторожно. В сухую пробирку помещают 2,1 мл реактива Либермана-Бурхарда, очень медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови, энергично встряхивают пробирку, а затем термостатируют 20 мин при 37ºС. Развивается изумрудно-зеленая окраска, которую колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре (630-690 нм) против реактива Либермана-Бурхарда. Полученную на ФЭКе оптическую плотность используют для определения концентрации холестерина по калибровочному графику. Найденную концентрацию холестерина умножают на 1000, так как сыворотки в опыт берется 0,1 мл. Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,0258. Нормальное содержание общего холестерина (свободного и эстерифицированного) в сыворотке крови 2,97-8,79 ммоль/л (115-340 мг%).

 

Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора холестерина, где в 1 мл содержится 1,8 мг холестерина, берут по 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 мл и доводят до объема 2,2 мл реактивом Либермана-Бурхарда (соответственно 2,15; 2,1; 2,05; 2,0; 1,95 мл). Количество холестерина при этом в пробе составляет 0,09; 0,18; 0,27; 0,36; 0,45 мг. Полученные стандартные растворы холестерина, так же как и опытные пробирки, энергично встряхивают и помещают в термостат на 20 мин, после чего фотометрируют. Калибровочный график строят по величинам экстинкций, полученных в результате фотометрирования стандартных растворов.

 

Клинико-диагностическое значение. При нарушении жирового обмена холестерин может накапливаться в крови. Увеличение содержания холестерина в крови (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, механической желтухе, нефрите, нефрозе (особенно липоидных нефрозах), гипотиреозе. Понижение холестерина в крови (гипохолестеринемия) наблюдается при анемиях, голодании, туберкулезе, гипертиреозе, раковой кахексии, паренхиматозной желтухе, поражении ЦНС, лихорадочных состояниях, при введении инсулина.