Работа 43. Количественное определение углеводов

Раздел 2. Обмен углеводов

Трис-буфер (0,05 М), рН 7,2-9,1

Бикарбонатный буфер (0,1 М), рН 9,2-10,8

Фосфатный буфер (0,1М), рН 5,8-8,0

Двузамещенный фосфат натрия, Na₂HPO₄*2H₂O, мол.масса = 178,05

Двузамещенный фосфат натрия, Na₂HPO₄*12H₂O, мол.масса = 358,22

Однозамещенный фосфат натрия, NaH₂PO₄*H₂O, мол.масса = 138,0

Однозамещенный фосфат натрия, NaH₂PO₄*2H₂O, мол.масса = 156,03

рН	Na₂HPO₄ (0,2 М), мл	NaH₂PO₄* (0,2 М), мл	Вода, мл	рН	Na₂HPO₄ (0,2 М), мл	NaH₂PO₄* (0,2 М), мл	Вода, мл
5,8	8,0	92,0	До 200	7,0	61,0	39,0	До 200
6,0	12,3	87,7	» 200	7,2	72,0	28,0	» 200
6,2	18,5	81,5	» 200	7,4	81,0	19,0	» 200
6,4	26,5	73,5	» 200	7,6	87,0	13,0	» 200
6,6	37,5	62,5	» 200	7,8	91,5	8,5	» 200
6,8	49,0	51,0	» 200	8,0	94,7	5,3	» 200

Этот буфер не может быть использован, если в среде присутствуют ионы кальция или магния.

Карбонат натрия (Na₂CO₃*10H₂O), мол.масса = 286,2

Бикарбонат натрия NaHCO₃, мол.масса = 84,0

рН при	Na₂CO₃ (0,1 М), мл	NaHCO₃, (0,1 М), мл	рН при	Na₂CO₃ (0,1 М), мл	NaHCO₃, (0,1 М), мл
20°С	37°С	20°С	37°С
9,16	8,77			10,14	9,90
9,40	9,12			10,28	10,08
9,51	9,40			10,53	10,28
9,78	9,50			10,83	10,57
9,90	9,72

Трис, мол.масса = 121,14

рН	Трис (0,2 М), мл	HCl (0,1 М), мл	Вода, мл
23°С	37°С
9,10	8,95		5,0	До 100
8,92	8,78		7,5	» 100
8,74	8,60		10,0	» 100
8,62	8,48		12,5	» 100
8,50	8,37		15,0	» 100
8,40	8,27		17,5	» 100
8,32	8,18		20,0	» 100
8,23	8,10		22,5	» 100
8,14	8,00		25,0	» 100
8,05	7,90		27,5	» 100
7,96	7,82		30,0	» 100
7,87	7,73		32,5	» 100
7,77	7,63		35,0	» 100
7,66	7,52		37,5	» 100
7,54	7,40		40,0	» 100
7,36	7,22		42,5	» 100
7,20	7,05			» 100

Углеводы в организме человека играют важную роль и выполняют разнообразные функции. Наиболее важная из них – энергетическая, поскольку 60-70% всей энергии, которая используется организмом для нормальной жизнедеятельности, приходится на углеводы. Основным источником энергии является окисление гликогена и глюкозы в тканях. Большую роль в энергетическом снабжении клетки играют коферменты (NAD+, FAD⁺ и др.), в состав которых входит рибоза.

Для количественного определения глюкозы используются следующие методы:

1. Редуктометрические. Основаны на свойстве сахаров восстанавливать соли тяжелых металлов в щелочной среде (титрометрический метод Хагедорна-Йенсена). Недостаток этих методов состоит в том, что они не специфичны, так как присутствующие в крови редуцирующие вещества, не являющиеся углеводами, также обладают восстанавливающими свойствами и полученные результаты включают всю сумму восстанавливающих соединений в крови. В связи с этим количество сахара в крови получается значительно выше истинного количества глюкозы. Однако этот метод сохраняет клиническое значение, поскольку разность между «кажущимся» сахаром крови и «истинной» глюкозой у одного и того же лица остается постоянной.

2. Колориметрические. Основаны на определении степени интенсивности окраски соединений, образующихся при взаимодействии глюкозы с определенным веществом (ортотолуидиновый метод). Метод специфичен и точен.

3. Энзиматические. Основаны на действии фермента глюкозооксидазы, окисляющей глюкозу до глюконовой кислоты кислородом воздуха (глюкозооксидазный метод). Этот метод специфичен и широко применяется в клинико-диагностических лабораториях.

Определение содержания глюкозы в сыворотке крови энзиматическим методом

Принцип метода. Метод основан на специфическом окислении глюкозы под влиянием глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4), обладающей высокой субстратной специфичностью по отношению к глюкозе. Этот метод позволяет определить содержание глюкозы в крови в присутствии других восстанавливающих веществ.

Глюкозооксидаза - флавопротеин, простетической группой которого является FAD⁺. Окисление глюкозы глюкозооксидазой происходит у первого углеродного атома до глюконовой кислоты через промежуточный продукт δ-глюконолактон. Перенос двух атомов водорода на FAD⁺ приводит к его восстановлению, а затем FADH₂ передает их на кислород с образованием перекиси водорода в эквимолярных количествах. Образовавшийся пероксид водорода определяется по реакции окислительной конденсации хлорпроизводного фенола с 4-аминофеназоном, катализируемой пероксидазой. Интенсивность возникшей окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на ФЭКе (длина волны 500 нм, кювета с длиной светового пути 5 мм).

Исследуемый материал: кровь.

Реактивы: эталонный раствор глюкозы (10 ммоль/л), дистиллированная вода, рабочий реактив (содержит глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-хлор-3-метилфенол, 4-аминофеназон).

Оборудование: пробирки центрифужные, пробирки химические, микропипетки, стеклянные пипетки, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, ФЭК, центрифуга, термостат.

ХОД РАБОТЫ. Из ушной вены кролика собирается 2 мл крови. Для образования сгустка цельную кровь выдерживают при комнатной температуре 5 мин. После этого кровь центрифугируется на центрифуге 10 мин при скорости вращения ротора 3000 об/мин для получения сыворотки. В полученной сыворотке крови определяют содержание глюкозы. Для этого готовят пробы, согласно приведенной таблице.

Раствор	Исследуемая проба (А)	Эталон (Э)	Контроль
Сыворотка крови (мл)	0,02
Глюкоза (мл)		0,02
Дистиллированная вода (мл)			0,02
Рабочий реактив

Содержимое каждой пробирки перемешивают, после чего пробирки помещают в термостат на 15 мин при температуре 37ºС.

Измеряют оптическую плотность опытных проб (А) и эталона (Э) против контрольного раствора на ФЭКе (длина волны 500 нм).

Расчет производят по формуле:

Глюкоза (ммоль/л)=10·А/Э.

Содержание глюкозы в сыворотке крови у человека в норме колеблется от 3,6 ммоль/л до 6,7 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение. Увеличение содержание глюкозы в крови (гипергликемия) наблюдается при сахарном диабете, остром панкреатите, панкреатических некрозах, эмоциональных стрессах, после эфирного наркоза, обильного приема углеводов с пищей, а также при повышении гормональной активности ряда желез (щитовидной, гипофиза, коркового и мозгового вещества надпочечников). Снижение уровня глюкозы в крови (гипогликемия) встречается при поражении паренхимы печени, нарушении ферментативной активности при распаде гликогена, недостаточной функции щитовидной железы, надпочечников, гипофиза, передозировке инсулина при лечении сахарного диабета, нарушении всасывания углеводов, отравлениях фосфором, бензолом, хлороформом, при недостатке приема с пищей углеводов, после больших потерь крови.

Работа 44. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови

Уровень глюкозы в крови находится под контролем нервной системы и эндокринных желез, поэтому в здоровом организме возможны лишь кратковременные его колебания. Это происходит при стрессовых реакциях, болевых приступах, эмоциональных возбуждениях и связано с выбросом в кровь значительного количества адреналина и АКТГ. Стойкая гипер- и гипогликемия наблюдается при нарушении функции поджелудочной железы и надпочечников.

Инсулин при введении в организм вызывает снижение уровня глюкозы в крови и применяется при лечении сахарного диабета. Особенно чувствительна к снижению уровня глюкозы в крови центральная нервная система, так как глюкоза является для нее основным источником энергии. Поэтому, вводя инсулин с лечебной целью при сахарном диабете, необходимо следить за уровнем глюкозы (гипогликемия может вызвать судороги и привести к летальному исходу). В таких случаях нужно срочно ввести глюкозу или адреналин. Понижение уровня глюкозы в крови под влиянием инсулина обусловлено тем, что он стимулирует синтез гликогена из глюкозы в печени и мышцах и тормозит распад гликогена в печени. Инсулин способствует превращению всосавшихся углеводов в жиры, увеличивает проницаемость клеточных мембран в мышечной и жировой тканях для глюкозы, способствуя переходу глюкозы из крови в ткани и ее окислению. Инсулин устраняет тормозящее действие глюкокортикоидов на гексокиназу (увеличивает ее активность), стимулирует цикл трикарбоновых кислот, угнетает активность глюкозо-6-фосфатазы и аденилатциклазы, активирует гликогенсинтазу.

Исследуемый раствор: кровь.

Реактивы: препарат инсулина, гепарин, стерильный физиологический раствор (0,9%-ный раствор NaCl), этиловый спирт, стерильный 40%-ный раствор глюкозы, реактивы для количественного определения концентрации глюкозы (см. работу 43).

Оборудование: пипетки, химические пробирки, центрифужные пробирки, лезвие, вата, шприц, химические стаканы, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм.

ХОД РАБОТЫ. Кровь берут из ушной вены кролика до введения инсулина и определяют в ней содержание глюкозы. Для предотвращения свертывания крови пробирку для взятия крови обрабатывают гепарином. Инсулин вводят кролику из расчета 1,5 МЕ на 1 кг массы. Препарат инсулина содержит обычно от 20 до 40 МЕ в 1 мл. Его разводят физиологическим раствором так, чтобы взятое количество единиц инсулина содержалось в 3-х мл раствора. Из шприца вытесняют пузырьки воздуха, оставляя в нем 2 мл раствора инсулина, которые вводят кролику подкожно. Через 1 час после введения инсулина у кролика повторно берут кровь и определяют в ней содержание глюкозы. По окончании опыта кролику обязательно вводят 40%-ный раствор глюкозы подкожно.

Работа 45. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови

Адреналин в высоких концентрациях - сильный яд. Его физиологическое действие проявляется в ничтожно малых количествах – 0,0001 мг на 1 кг массы. Он быстро разрушается в желудочно-кишечном тракте, поэтому вводят адреналин подкожно и внутримышечно. При подкожном введении адреналина содержание глюкозы в крови увеличивается, наступает гипергликемия и, если уровень ее достигает 8,88 ммоль/л, начинается выделение глюкозы с мочой (глюкозурия). Адреналин оказывает влияние на углеводный обмен, усиливая распад гликогена в печени до глюкозы. Адреналин через аденилатциклазу и 3’-5’-сАМР вызывает превращение неактивной фосфорилазы «b» в активную фосфорилазу «a», катализирующую распад гликогена в печени. Адреналин в крови инактивируется ферментом моноаминооксидазой. В крови в тканях наряду со свободным адреналином обнаружен комплекс адреналина с белком, который способствует сохранению адреналина в организме. Вводя адреналин в организм кролика и определяя содержание глюкозы до и после введения, можно установить его влияние на углеводный обмен.

Исследуемый материал: кровь.

Реактивы: препарат адреналина, гепарин, стерильный физиологический раствор (0,9%-ный раствор NaCl), этиловый спирт, стерильный 40%-ный раствор глюкозы, реактивы для количественного определения концентрации глюкозы (см. работу 43).

ХОД РАБОТЫ. У кролика берут кровь из ушной вены до введения адреналина и определяют в ней содержание глюкозы глюкозооксидазным методом. После этого кролику подкожно вводят 0,1%-ный раствор адреналина из расчета 0,3 мл на кг массы тела. Через 30 мин после введения адреналина у кролика снова берут кровь и определяют в ней содержание глюкозы.