Работа 38. Открытие пероксидазы
Работа 37. Идентификация оксидоредуктаз в биологическом материале
Открытие ферментов различных классов
Работа 36. Специфичность действия сахаразы
Сахараза катализирует расщепление сахарозы с образованием глюкозы и фруктозы. Действие сахаразы можно обнаружить по появлению в инкубационной среде свободной глюкозы, дающей положительную реакцию Троммера вследствие наличия в молекуле глюкозы свободного полуацетального альдегида. Сахароза не обладает восстанавливающими свойствами.
Исследуемый материал: препарат сахаразы.
Реактивы: 1%-ный раствор крахмала, 1%-ный раствор сахарозы, 10%-ный раствор NaOH, 1%-нвй раствор CuSO4, реактив Люголя, дистиллированная вода.
Оборудование: пробирки, пипетки, термостат.
ХОД РАБОТЫ. Готовят 2 инкубационные пробы, как указано в таблице, используя в качестве субстратов для сахаразы 2 вещества – крахмал и сахарозу.
| № пробы | Сахараза (мл) | Крахмал (мл) | Сахароза (мл) | Реакция Троммера (+, -) | Реакция с йодом (+,-) |
Пробы выдерживают в термостате 15 мин при 37˚С. Затем со второй пробой проделывают 2 реакции: Троммера и реакцию с йодом. С первой пробой проделывают реакцию Троммера.
Оформление работы. Вносят в таблицу результаты реакций. Делают вывод о специфичности сахаразы.
Все ферменты делят на 6 классов в зависимости от типа реакций, ими катализируемых.
1. Оксидоредуктазы – ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.
2. Трансферазы – ферменты, катализирующие реакции переноса различных групп.
3. Гидролазы – ферменты, ускоряющие реакции гидролиза.
4. Лиазы – ферменты, отщепляющие от субстрата определенные группы негидролитическим путем с образованием двойной связи или. Наоборот, присоединяющие группы к двойным связям.
5. Изомеразы – ферменты, ускоряющие реакции изомеизации.
6. Лигазы (синтетазы) – ферменты, катализирующие реакции синтеза.
В реакциях, катализируемых оксидоредуктазами, окисляемый субстрат является донором водорода или электронов, роль акцептора могут выполнять различные соединения – коферменты NAD (P), FMN, FAD, CoQ, O2, органические соединения, цитохромы, ксенобиотики. Для большинства ферментов этой группы рекомендуемые названия – дегидрогеназы или редуктазы. Когда акцептором служит О2, используется термин оксидаза, если О2 внедряется в субстрат, фермент называется оксигеназа. Пероксидаза - фермент, который утилизирует Н2О2 как акцептор. Каталаза – фермент, способный катализировать реакцию, в которую вовлекается донор-акцепторная пара, представленная двумя молекулами перекиси водорода.
Ферменты, окисляющие субстраты при участии перекиси водорода, называются пероксидазами. Пероксидазы встречаются особенно широко в растительных клетках, у животных находятся в крови, мышцах, молоке. Субстратами пероксидаз служат фенолы и ароматические амины ( пирогаллол, гваякол, гидрохинон, тирозин, бензидин и др.). Пероксидазы представляют собой протеиды, содержащие в качестве активной группы железопорфириновый комплекс. Вследствие этого они угнетаются HCN, H2S, гидроксиламином, тиомочевиной. Пероксидазы угнетаются также перекисью водорода, поэтому необходимо следить за тем, чтобы избытка ее при пробах на пероксидазу не было. Пероксидазы по сравнению с другими ферментами довольно стойки к инактивации нагреванием.
Исследуемый материал: экстракт хрена.
Реактивы: 0,5%-ный раствор Н2О2, гваяковая смола.
Оборудование: пробирки, пипетки.
ХОД РАБОТЫ. Добавить к 0,5 мл взвеси измельченного в воде хрена 0,1 мл перекиси водорода и 0,5 мл гваяковой смолы. Появляется интенсивное окрашивание образовавшейся индофеноловой сини.