Специфичность действия ферментов

Влияние рН на активность амилазы слюны

Работа 34. Влияние рН на активность амилазы слюны

Влияние рН на скорость ферментативных реакций

Влияние температуры на активность холинэстерзы

 

№ пробирки	Температура инкубации, ˚С	Окрашивание с бромтимоловым синим

 

Все ферменты проявляют максимальную активность при определенном оптимальном значении рН. Ниже и выше оптимума рН наблюдается снижение активности ферментов. Зависимость активности от рН объясняется влиянием на степень ионизации ионогенных групп фермента, а также субстрата.

 

Оптимум рН для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН среды. О степени расщепления крахмала можно судит по реакции крахмала с раствором йода. При оптимальном значении рН расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутсвует). По мере удаления от оптимума рН в кислую или щелочную зоны расщепление крахмала произойдет только частично до стадии декстринов или крахмал вообще не подвергнется расщеплению.

 

Исследуемый материал: слюна.

Реактивы: 1%-ный раствор крахмала, реактив Люголя, 1/15М растворы фосфатного буфера с разными значениями рН (5,5-8,0).

Оборудование:пробирки, пипетки, термостат.

 

ХОД РАБОТЫ. Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл крахмала, 0,5 мл разбавленной (1:5) слюны. Затем в первую пробирку добавляют 0,5 мл буфера с рН 5,8, во вторую пробирку – 0,5 мл буфера с рН 6,5, в третью – 0,5 мл буфера с рН 7,0 и в четвертую – 0,5 мл буфера с рН 8,0. Помещают все пробирки на 10 мин в термостат (37˚С). После этого добавляют по 2 капли реактива Люголя во все пробирки и наблюдают за развитием окраски.

 

Оформление работы. Результаты записывают в таблицу. Делают выводы о характере влияния рН на активность амилазы.

 

 

№ пробирки	РН	Окрашивание с йодом
	5,5
	6,5
	7,0
	8,0

 

Специфичность действия выражается в способности ферментов катализировать реакции одного стереоизомера, одного определенного субстрата или группы сходных по строению субстратов, характеризующихся определенным типом химической связи или наличием определенной химической группировки. Это свойство наиболее важное среди свойств биологических катализаторов. Оно обусловлено наличием в молекуле фермента активного центра, ответственного за каталитическую активность, формирование которого происходит под влиянием субстрата в момент взаимодействия. Специфичность действия в работе изучается на примере α-амилазы слюны и сахаразы, полученной из дрожжей.

 

Работа 35. Специфичность действия α-амилазы слюны

 

α-амилаза катализирует гидролитическое расщепление крахмала с образованием мальтозы. Промежуточными продуктами в данной реакции являются различные декстрины ( амино-, эритро-, ахро-, мальтодекстрины). Степень гидролиза крахмала можно контролировать по цветной реакции с йодом. Крахмал дает с йодом синее окрашивание, декстрины в зависимости от размеров молекул окрашиваются с йодом в разные цвета (сине-фиолетовый, красно-бурый, желто-бурый), а конечные продукты с йодом окраски не дают. Второй контрольной пробой может быть реакция на наличие свободных альдегидных групп.

 

Исследуемый материал: слюна

Реактивы: 1%-ный раствор крахмала, 1%-ный раствор сахарозы, 10%-ный раствор NaOH, 1%-ный раствор CuSO₄, реактив Люголя, дистиллированная вода.

Оборудование:пробирки, пипетки, термостат.

 

ХОД РАБОТЫ. Готовят 2 инкубационные пробы, как указано в таблице, используя в качестве субстратов для амилазы 2 вещества – крахмал и сахарозу.

 

№ пробы	Амилаза слюны (мл)	Крахмал (мл)	Сахароза (мл)	Реакция Троммера (+, -)	Реакция с йодом (+,-)

 

Пробы выдерживают в термостате 15 мин при 37˚С. Затем с первой пробой проделывают 2 реакции: Троммера и реакцию с йодом. Со второй пробой проделывают реакцию Троммера.

 

Оформление работы. Вносят в таблицу результаты реакций. Делают вывод о специфичности амилазы.