Метод секвенування за Сенгером

Метод базується на синтезі радіоактивно міченого комплементарного ланцюга ДНК з використанням фрагмента наітивної ДНК в якості матриці. Синтез проводиться за допомогою фермента ДНК–полімерази І. В реакційній суміші присутні 4 дезоксирибонуклеозидтрифосфати, з яких і синтезується комплементарний ланцюг ДНК. Крім них в суміші знаходиться модифікована форма однієї з основ ( 2′,3′- дидезоксирибонуклеозидтрифосфат), при включенні якого синтез зупиняється. Утворюються ланцюжки різної довжини. Використовується 4 різних реакційних суміші, в кожну з яких крім дезоксирибонуклеотидів додають один з 4 можливих дидезоксирибонуклеотидів в якості термінатора. Ланцюги різної довжини розділяють за допомогою електрофореза в поліакріламідному гелі. Одержують радіоафтографію і безпосередньо з плівки зчитують послідовність нуклеотидів. Для полегшення секвенування за методом Сенгера використовується клонування фрагментів ДНК в М 13, який є бактеріофагом, що складається з одноланцюгової ДНК, запакованої у білковий каскад. При інфікуванні E.coli фагом М 13 утворюється дволанцюговий ("+"/"-") проміжний продукт (реплікативна форма), яка потім направляється або на синтез інших копій реплікативної форми мРНК, або копій (+)ДНК фагового геному. Реплікативну форму можна використовувати як вектор для клонування. Вона має невеликі розміри - 7200 п.н. і містить унікальні сайти рестрикції. Фрагменти чужорідної ДНК завжди включаються в одну і ту саму ділянку реплікативної форми М 13.

 

М 13 EcoRI

ACGTCGTGACTGCA

TGCAGCACTGACGT

- послідовність ДНК фага М 13

з ділянкою клонування

 

В якості затравки можна використати комплементарний цій послідовності олігонуклеотид, що синтезують хімічним шляхом.

Цей метод дозволив Сенгеру секвенувати всі 48 513 нуклеотидів фага λ з великою швидкістю.