Ендонуклеази рестрикції

Ендонуклеази рестрикції (рестриктази) – це ферменти, що специфічно гідролізують молекули дволанцюгових ДНК при наявності в них певних послідовностей нуклеотидів, які називаються сайтами рестрикції. За механізмом дії та молекулярною структурою розпізнають три типа рестриктаз. В технології рекомбінантний ДНК використовуються рестриктази ІІ-го типу , які впізнають специфічні послідовності нуклеотидів у точці розщеплення ДНК, або в безпосередній близькості від неї. Для прояву активності вони потребують певних умов – наявності в рестрикційній суміші АТР та іонів Mg2+ .

Назви рестриктаз складаються з перших літер видових назв бактерій, в яких їх виявили, наприклад Eco – Escherichia coli (це одна з перших ендонуклеаз рестрикції). В деяких випадках позначають штам бактерій, з яких виділили ферменти, наприклад Hinc і Hind –рестриктази з клітин Haemophilus influenzae, штами с і d . Цифри в назві ферментівозначають порядковий номер відкриття відповідних рестриктаз, наприклад HaeI, HaeIІ, HaeIІІ – ферменти із Haemophilus aegipticus (табл.3).

Більшість рестриктаз типу ІІ впізнають на ДНК певні тетра- і гексануклеотидні послідовності, але зустрічаються рестриктази, що впізнають послідовності з п’яти і восьми нуклеотидів (табл.6).

Деякі рестриктази, такі як HindІІ, розщеплюють ДНК в середині сайта впізнавання і утворюють сегменти з “тупими кінцями”:

HindІІ
5′ -GTC↓GAC – 3 3′ -CAG↓CTG - 5′
5′ -GTC 3′ -CAG	GAC - 3′ CTG - 5′

Інші ферменти, такі як EcoRI, утворюють розриви, які проходять навскіс таким чином, що на кінці кожного ланцюга дуплекса ДНК лишаються короткі одноланцюгові хвости, відомі як “липкі кінці”:

 

EcoRI
5′ - GAATTC - 3′ 3′ - CTTAAG - 5′
5′ -G 3′ -CTTAA	AATTC - 3′ G - 5′

“Липкі кінці” можна з’єднувати між собою та “липкими кінцями” інших ДНК.

Деякі рестриктази, такі як BamHI, BclI, BglII, XhoII, впізнають різні сайти рестрикції, але утворюють однакові “липкі кінці” - GATC. Утворення “липких кінців” певної послідовності (NCGA) характерно і для групи рестриктаз SalI, XhoI, AvaI . При зшиванні за допомогою лігази фрагментів ДНК, утворених рестриктазами однієї з цих груп, відбувається їх об’єднання, але при цьому губляться початкові сайти рестрикції, в результаті чого утворюються нові послідовності нуклеотидів.

Рестриктази, що впізнають одну й ту саму нуклеотидну послідовність називають ізошизомерами. Більшість сайтів рестрикції – поліндроми:

 

EcoRI 5′ - GAATTC - 3′

3′ - CTTAAG - 5′

 

KpnI 5′ - GGTACC - 3′

3′ - CCATGG - 5′

Сайти деяких рестриктаз асиметричні:

 

HgaI 5′ - GACGC(N5) ↓- 3′

3′ - CTGCG(N5)(N5)↓- 5′

Таким чином утворюються унікальні фрагменти. При конструюванні рекомбінантнх молекул часто використовують штучні сайти рестрикції для кількох рестриктаз одразу – полілінкери – синтезовані хімічним шляхом олігонуклеотиди.

Обробка зразка ДНК певною рестриктазою дає постійний набір фрагментів при умові, що розщеплення відбувається по всім сайтам впізнавання. Якщо задіяти декілька ферментів рестрикції, то можна побудувати рестрикційну карту даної ДНК – послідовність знаходження сайтів рестрикції вздовж молекули. Для цього ДНК обробляють спочатку кожною з рестриктаз, а потім їх сумішшю. Розміри одержаних фрагментів визначаються методом гель-електрофорезу, при цьому спостерігається міграція фрагментів ДНК в тонкому шарі агарозного поліакріламідного геля. Швидкість міграції залежить від довжини фрагмента. Молекули ДНК не денатурують, їх можна виділити у вигляді біологічно активних дволанцюжкових молекул. Гелі обробляються спеціальними барвниками, які зв’язуються з ДНК і утворюють набір чітких смуг. Використання рестрикційних карт дозволило ідентифікувати генетично важливі ділянки ДНК і розробити методи секвенування нуклеїнових кислот.

Таблиця 3

Сайти рестрикцій найбільш відомих рестриктаз при нормальних умовах

Мікроорганізми	Скорочення	Послідовність 5′ - 3′ 3′ - 5′
Bacillus amulolique- fasiens H	BamHI	G↓GATCC CCT↓AG↑G
Brevibacterium albidum	BalI	TGGCCA ACC↑GGT
Escherichia coli RY13	EcoRI	G↓AATTC CTTAA↑G
Haemjphilus aegyptius	HaeII	PuGCGC↓Py Py↑CGCGPu
Haemjphilus aegyptius	HaeIII	GG↓CC CC↑GG
Haemjphilus haemolyticus	HhaI	GCG↓C C↑GCG
Haemjphilus influenzae Rd	HindII	GTPy↓PuAC CAPu↑PyTG
Haemjphilus influenzae Rd	HindIII	A↓AGCTT TTCGA↑A
Haemjphilus parainfluenzae	HpaI	GTT↓AAC CAA↑TTG
Haemjphilus parainfluenzae	HpaII	C↓CGG GGC↑C
Providencia stuartii 164	PstI	CTGCA↓G G↑ACGTC
Streptomyces albus G	SalI	G↓TCGAC CAGCTG
Xanthomonas oryzae	XorII	CGATC↓G G↑CTAGC

 

 

Таблиця 4