Векторні системи експресії для дріжджів
Існує три типи експресуючих векторів на основі дріжджів Saccharomyces cerevisiae: 1) плазмідні вектори; 2) інтегруючі вектори; 3) штучні дріжджові хромосоми.
Плазмідні вектори для S.cerevisiae (рис.3) сконструйовані на основі природної дріжджової плазміди довжиною 6300 п.н., що одержала назву 2μ-кільце, здатна до самостійної реплікації завдяки наявності ділянки ori та білків підтримуючих ампліфікацію плазміди на постійному рівні (ділянки М1 та М2). Для проведення попередніх операцій в E.coli вектор сконструйований як бінарний та містить фрагменти плазміди pBR322: ділянку ori E.coli та селективний маркер Amp. В якості селективних маркерів для дріжджових клітин використовуються гени, що кодують ферменти біосинтезу лейцину (leu), триптофану (trp), гістидину (his), аргініну (arg), урацилу (ura). Кодуюча ДНК знаходиться між промотором та сигналами термінації-поліаденілірування S.cerevisiae (Р і Т). Для забезпечення секреції синтезованих білків із дріжджових клітин необхідно використовувати спеціальні системи секреції. В S.cerevisiae таку роль відіграє так званий про-α-фактор – лідерна (сигнальна) послідовність гену α-фактору парування дріжджів , який розміщується перед к-ДНК.
Інтегруючі вектори обов’язково містять послідовності, комплементарні певним ділянкам хромосомної ДНК. Однак, такі векторні системи для S.cerevisiae не одержали широкого розповсюдження.
Частіше використовується інтегруючий експресуючий вектор на основі метилотрофних дріжджів Pichia pastoris (рис.4). Наявність метанолу регулює активність гену алкогольоксидази, яка синтезується тільки в його присутності в великій кількості (до 30% всіх клітинних білків). Вектор містить послідовності плазміди pBR322 (ori для E.coli та Amp), що полегшує клонування. Для самостійної реплікації вектор містить ділянку ori для P.pastoris. Інтеграція в геном P. pastoris відбувається в результаті подвійного кросинговеру .
Штучна дріжджова хромосома (YAC) на основі S.cerevisiae (рис.5) містить сайт ініціації реплікації для E.coli та селективний маркер Amp; фрагмент дріжджової
|
BamHI, SmaI, лужна фосфотаза
+
к-ДНК, лігування
ДНК для забезпечення автономної реплікації, центромерну ділянку дріжджової хромосоми та послідовності, що виконують функції теломер та стабілізують лінійну форму. Між цими послідовностями знаходяться сайти рестрикції для вбудування послідовностей, що клонуються.YAC системи надзвичайно стабільні і використовуються для клонування фрагментів ДНК більше 100 т.п.н.