Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры)

Для исследования вариабельности генома в целом может быть также использован метод анализа AFLP. Этот метод также не требует ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК. Особености этого подхода заключаются в использовании в качестве матрицы рестрицированных фрагментов ДНК, лигированных со специфическими олигонуклеотидными адаптерами, и проведении избирательной амплификации со специально сконструированными праймерами. Праймеры состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы (~ 15 нуклеотидов), и короткого фрагмента (на 3'-конце) с произвольной последовательностью нуклеотидов (2-4 нуклеотида) [57, 88]. Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75-100 фрагментов (AFLP-финргерпринтинг), которые разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа полиморфизма ДНК. С одного геля обычно удается получить до 40 полиморфных локусов. Этот тип полиморфизма ДНК также имеет доминантный тип наследования. AFLP-маркеры часто наследуются как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров, что позволяет, используя этот подход, быстро генерировать сотни высоковоспроизводимых маркеров [68]. AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования [55, 85], в популяционных и филогенетических исследованиях [25]. В последние годы эти маркеры получают все более широкое распространение для исследования мало изученных таксономических групп.

ISSR. Для создания ISSR-маркеров используют праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов (так называемый "якорь"). Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными последовательностями (как правило, это уникальная ДНК). В результате амплифицируется большое число фрагментов, представленных на электрофореграмме дискретными полосами (ISSR-фингерпринтинг). Полученные паттерны ПЦР-продуктов видоспецифичны [38, 101]. ISSR-маркеры также относятся к маркерам доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию/отсутствию полосы. Аналогично RAPD и AFLP для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. Метод обладает хорошей воспроизводимостью и наряду с AFLP может быть с успехом использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в ряде случаев и для индивидуального генотипирования [38, 61, 101]. ISSR-маркеры могут быть использованы также для картирования геномов и маркирования хозяйственно-полезных признаков [33, 45].

Микросателлиты

Микросателлиты - первые, полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов. Подобно минисателлитам, микросателлиты относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетрануклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п.н.). Эти маркеры известны под несколькими названиями: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short tandem repeat), SSR (simple sequence repeat) [54, 82, 93]. По аналогии с системой STS была предложена система STMS, которая фактически является частью системы STS. Для создания STR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм STR определяется различной копийностью мономерных единиц в кластере, что приводит к существованию множественных аллельных вариантов. Гетерозиготность их очень высока (часто более 75%). При создании новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, используются микросателлиты три- и тетрамерных мотивов, значительная часть которых также высокогетерозиготна. Благодаря большей длине звена, применение тримеров и тетрамеров позволяет упростить методику анализа аллельного полиморфизма.

Микросателлиты широко распространены в эукариотических геномах (как растительных, так и животных). Например, в геноме человека динуклеотидные повторы встречаются в среднем каждые 2 т.п.н.

Согласно общепринятой точке зрения, полиморфизм микросателлитов обусловлен ошибками (эффект "проскальзывания") в процессе репликации или репарации ДНК [83]. Средний темп мутирования динуклеотидных повторов оценивают примерно в 6,9х10-4 [99], хотя эти оценки могут существенно различаться [49].

Высокий уровень полиморфизма микросателлитов, относительно равномерное их распределение в эухроматиновой части геномов и широкая представленность сделали их чрезвычайно популярными. Применение их при картировании генома человека позволило совместить физические и генетические карты хромосом. Гипервариабельные микросателлиты представляют собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК и широко используются в исследованиях генетического полиморфизма популяций человека, растений и животных.

Несмотря на высокую популярность микросателлитов, они имеют и некоторые недостатки. Неравномерность скорости мутирования разных микросателлитов создает определенные сложности для популяционно-генетического анализа. Имеются и технические проблемы, такие как артефакты при проведении ПЦР (за счет эффекта "проскальзывания"), сложности в разработке технологий для автоматического скрининга микросателлитных аллелей. Кроме того, несмотря на высокую плотность микросателлитных локусов в геноме, их бывает недостаточно для тонкого картирования отдельных областей геномов, создания маркеров для локусов количественных признаков (QTL) и решения многих других задач.