ДНК-маркеры на основе ПЦР с праймерами, имеющими множественную локализацию в геноме

Особый класс ДНК-маркеров основан на использовании праймеров, имеющих множественную локализацию в геноме. Это может быть достигнуто при использовании одного короткого праймера с произвольной последовательностью (RAPD - Randomly amplified polymorphic DNA и ее аналогов), при использовании праймеров с искусственно добавленными последовательностями (адаптерами) (AFLP - Amplified fragment length polymorphism) или праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома, таким как микросателлиты (ISSR - Inter-simple-sequence-repeats) или транспозоны (IRAP- Inter-retransposon amplified polymorphism).

RAPD-маркеры. К этой группе относятся маркеры, основанные на ПЦР с применением праймеров с произвольной, случайной последовательностью. Для синтеза таких праймеров нет необходимости в знании конкретных нуклеотидных последовательностей генома исследуемого организма. Праймеры с произвольной последовательностью должны лишь отвечать определённым требованиям по соотношению GC-пар (около 60%) и длине. Этот метод был предложен независимо двумя группами исследователей и получил название RAPD (Random Amplified Polymophic DNA) или AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) [94, 95]. Суть метода заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием единичного короткого праймера с низкой температурой отжига в реакции ПЦР. Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках инвертированных повторов. При электрофоретическом разделении амплифицированных продуктов образуются дискретные продукты, размер которых варьирует от 100 до 5000 п.н. (ДНК-паттерны). Эти фрагменты представляют собой анонимную, как правило, уникальную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами. Различия в ДНК-паттернах определяются различиями в одном или обоих праймер-связывающих сайтах (наличие или отсутствие полосы ПЦР-продукта в спектре) или присутствием инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте (различия ПЦР-продуктов по размеру). Большинство RAPD-маркеров являются доминантными (наличие/отсутствие полосы в ДНК-паттерне) [95].
Несколько позже были предложены другие сходные технологии: DAF (DNA Amplified Fingerprinting) [27] и УП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) [3, 4]. Все описанные методики различаются размерами праймеров (10-12 нуклеотидов в случае RAPD, около 20 нуклеотидов в случае AP-PCR, 7-8 нуклеотидов в случае DAF и 25-27 нуклеотидов в случае УП-ПЦР), их составом (от 50 до 80% ГЦ-пар), температурой отжига и методами выявления продуктов реакции (окрашивание бромистым этидием, радиоавтография, серебрение).
RAPD-анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что особенно актуально для малоизученных таксономических групп. Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных [27, 92, 94, 95]. RAPD применяется также для геномного маркирования в популяционных и эволюционных исследованиях. Например, для разных видов грибов с помощью УП-ПЦР показана видоспецифичность ДНК-паттернов [3, 4]. Наиболее подробно с помощью RAPD-PCR изучались культурные растения, cельскохозяйственные и лабораторные животные с целью идентификации и дифференциации пород и отдельных линий, картирования хромосом и маркирования хозяйственно-ценных признаков [5, 8, 59]. Показаны ассоциации некоторых RAPD-маркеров с генами резистентности к различным болезням у растений [59].

К недостаткам метода следует отнести низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции: концентрации ионов магния, соотношению праймер/матрица, температурному режиму. Тем не менее RAPD-анализ может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма и как источник уникальных локус-специфичных маркеров.

Для получения локус-специфичных маркеров интересующий исследователя фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученного сиквенса подбирают праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости. Полученные таким способом вторичные маркеры названы SCAR-маркерами (Sequence Characterized Amplified Region) [67]. Многие из них кодоминантны и могут быть использованы как уникальные маркеры в различных областях исследований. Полиморфизм SCAR-маркеров может быть увеличен путем рестрикционного анализа ПЦР-продукта.