Выделение и анализ ДНК из бедренной кости № 4-46

Хронология экспертной работы:

30-31.1.97г /так!, скорее всего – “30-31.12.97”/ – приготовление лаборатории для проведения ДНК-анализа: обработка жестким УФ-облучением комнаты и оборудования;

31.1.97 /так!/ – в помещение лаборатории МГМ НЦ ПЗ РАМН доставлен фрагмент бедренной кости 4-46

1.1.98 – осмотр, обмер и фотографирование костного образца 4-46 (до изъятия костного материала);

2.1.98г – костный материал взят из участка кости 4-46 и начато выделение ДНК (лизис);

3.1.98г – выделение и очистка ДНК и первый раунд ПЦР-амплификации (умножения) мт участков ДНК;

4.1.98г – второй раунд ПЦР, электрофоретический анализ в агарозном геле и очистка ПЦР продуктов для определения нуклеотидной последовательности;

5-12.1.98г – определение нуклеотидных последовательностей ДНК ПЦР-продуктов; клонирование ПЦР-продуктов в pBSK (E. coli штаммы);

13-15.1.98г – два новых раунда ПЦР-амплификации мтДНК из костного образца;

13-22.2.98г – дополнительное определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов и клонированных фрагментов с серией различных олигонуклеотидных праймеров, сравнительный анализ мт ДНК Тихона Николаевича Куликовского-Романова и образца N 4-46.

Выделение, ПЦР-амплификация и дальнейший анализ ДНК осуществлялись непосредственно Рогаевым Е. И. Техническая и секретарская помощь со стороны др. сотрудников (не способная повлиять или изменить результат анализа) оказывалась только после стадии получения ПЦР-продуктов. Информация о существе проводимых экспериментов и соответствующих обозначений образцов, пробирок и т. д. была доступна только Рогаеву Е. И.

Экстракция ДНК

Условия:

Наиболее ответственным этапом при анализе ДНК из старых судебно-экспертных или антропологических образцов ДНК является этап экстракции ДНК.

Стерилизация приборов, оборудования и реактивов была осуществлена автоклавированием, обработкой этанолом и УФ-облучением. Комната, в которой проводилась экстракция ДНК, ПЦР-машина ("Амплификатор ДНК многоканальный МС2), настольные центрифуги, пипетки, растворы, перчатки и прочее оборудование и реактивы подвергались жесткому УФ-облучению перед каждым экспериментом и, по крайней мере, 3 раза в день.

Выделение ДНК и дальнейшие приготовления ДНК для ПЦР осуществлялись под потоком стерильного воздуха (Ламинар LIV 6020, Финляндия).

Фрагмент берцовой кости № 4-46 был осторожно обмыт:

1) в 1 л 1% SDS,

2) трижды в 1 л H₂O (стерильный),

3) дважды в 20% этаноле.

На первом этапе было решено взять небольшой субфрагмент из наименее сохраненной (рыхлой) части шейки берцовой кости № 4-46.

Костный материал из трех слоев (небольшое прямоугольное углубление в кости) был помещен в пробирки:

№ 2-1 (100 мг самого поверхностного осыпающегося слоя темного цвета)

№ 2-2 (200 мг следующего слоя темного и белого цвета)

№ 2-3 (350 мг в виде "пудры" из более глубокого слоя белого цвета).

ДНК выделяли из образца № 2-3. Была использована модификация методов выделения ДНК, адаптированная в данном случае для выделения ДНК из кости.

1) К «белому порошку» костного образца № 2-3 было добавлено 2 мл 0.5 MEDTA, 2 мг протеинозы (Boehringer), 2% SDS.

Декальцинирование и депротеинизацию проводили в течение 11-ти часов на 37° С.

2) К 1 мл лизата добавляли раствор AL («QIA amp blood kit») ( оставшуюся часть лизата заморозили и не брали для дальнейшего выделения). Далее выделение ДНК осуществляли согласно протоколу («QIA amp blood and tissue kit»), за исключением того, что промывку ДНК, иммобилизованной на фильтрах колонок, проводили 70% этанолом, вместо раствора AW.

Элюцию ДНК провели дважды Н₂О в объеме 400 мкл (образец Ni2 (Н₂О)). После этого для дополнительного контроля осуществили элюцию оставшихся следовых количеств ДНК (допуская, что таковые могут иметься) в тех же колонках, раствором АЕ (образец Ni2(AE)).

Концентрацию ДНК провели в колонках Centricon 30 до конечного объема 35 мкл. Первый раунд ПЦР участков HV1 и HV2 проводили с праймерами 903 и 904.

и 2-мя мкл ДНК из образцов Ni2 (Н₂О) или Ni2(AE) в условиях, описанных в «Материалах и методах» с использованием многоканального амплификатора отечественного производства (см. выше).

В качестве контроля использовалась геномная ДНК человека, выделенная из крови («положительный» контроль) и «пустые» (без ДНК) пробирки («отрицательныый» контроль).

После первого цикла ПЦР 1/3 объема ПЦР-продуктов наносилась в 1.2% агарозный гель, и после электрофоретической разгонки и окрашивания бромистым этидием ДНК визуализировали под УФ .

«Слабый» сигнал был отличен для образца Ni2(Н₂О) (HV1 область с 903/904 олигонуклеотидами), «сильный» сигнал для «положительного» контроля, и отсутствие сигналов для Ni2(AE) и «отрицательных» контролей.

В следующем цикле ПЦР были взяты те же нуклеотидные праймеры и 2 мл ПЦР-продукта Ni2(H₂O) (HV1 903/904) и «отрицательные» контроли. Две разные TaqI-полимеразы («Boehrinder» и «Biomaster») были использованы для данного цикла ПЦР.

Анализ в агарозном геле показал наличие большого количества ПЦР-продукта для Ni2 (HV1 903/904) образца. Не обнаружено каких-либо сигналов в «отрицательных» контролях. В дальнейшем, получение ПЦР-продукта для области HV2 было осуществлено с помощью mtF34 и mtR465 олигонуклеотидных праймеров по аналогичной схеме.

ПЦР-продукты очищались в 1% низкоплавком агарозном геле («BRL») и использовались для клонирования и секвенирования (определения нуклеотидных последовательностей).

Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли для:

1) ПЦР-продукта (А) (Ni2 HV1 903/904), полученного с помощью Bochringer TaqI-полимеразы,

2) ПЦР-продукта (B) (Ni2 HV1 903/904), полученного с помощью Biomaster TaqI-полимеразы,

3) плазмиды 1, содержащей клонированный ПЦР-фрагмент Ni2 HV1(903/904),

4) ПЦР-продукта NiC (Ni2 HV2 mtR34/mtF465).

Циклическую реакцию секвенирования осуществляли по стандартным протоколам («Promega» и «Amersham») для радиоактивного мечения или нерадиоактивного автоматического секвенирования (см. «Материалы и методы»).

Для секвенирования были использованы все олигонуклеотидные праймеры, использованные для ПЦР-амплификации, а также внутренние олигонуклеотидные праймеры (см. «Материалы и методы») и стандартные «прямые» и «обратные» М13 праймеры («Stratagene») для секвенирования клонированного фрагмента.

Всего было проведено 12 независимых реакций секвенирования и более 20-ти различных разгонок продуктов реакций секвенирования в полиакриламидных гелях. В результате нуклеотидные последовательности были определены несколько раз в независимых экспериментах с перекрывающихся комплиментарных нитей ДНК.