Лабораторного заняття № 7 з дисципліни «Генетична інженерія»

1. Тема заняття: «Будова рестрикційних карт ДНК»

2. Мета проведення заняття: вивчити будову рестрекційних карт ДНК.

 

2.1 Після виконаної роботи студент повинен

знати: На основі яких властивостей розрізняють рестриктази І і ІІ класів, що таке сайт рестрикції у молекулі ДНК, що таке ―ліпкі і ―тупі кінці фрагменту ДНК, одиниці вимірювання молекулярної маси ДНК.

вміти:визначити молекулярну масу ділянок ДНК, рекомбінантні ДНК, створювати банк генів та робити його скринінг.

3.План семінарського заняття:

Одними з основних ферментів генної інженерії є рестрикуючі ендонуклеази, тобто рестриктази, які здатні розрізати молекулу ДНК.

Розрізняють два класи рестриктаз. Рестриктази І класу розрізають ланцюг ДНК в будь-якому місті, при цьому створюється суцільний ряд рестриктів (окремих фрагментів ДНК), при кожної наступної обробці виявляється новий набір ділянок ДНК. Рестриктази ІІ класу розпізнають певні послідовності основ (сайти рестрикції) у дволанцюгових молекулах ДНК і розщеплюють обидва ланцюги.

Одна з перших рестриказ ІІ типу була виділена з бактерії Е.соІі і отримала назву ЕсоRІ. Крім ЕсоRІ, з бактеріальних клітин було отримано сотні рестриктаз ІІ типу, кожна з них має певний сайт рестрикції. Але розщеплення молекули ДНК може відбуватися як з утворенням, так званих, ―липких кінців‖, так і утворенням ―тупих кінців‖.

Обробка ДНК певною рестриктазою завжди дає один тої самий набір фрагментів – за умовою розщеплення по всіх сайтах рестрикції. Якщо використовувати однакові (клоновані) фрагменти ДНК і спочатку обробити ДНК кожної з рестриктаз окремо, а потім їх комбінацією, можливо побудувати фізичну карту даного фрагменту ДНК, тобто встановити порядок розташування сайтів рестрикції уздовж молекули. Розміри отриманих фрагментів визначають за допомогою гель-електрофорезу, принцип якого заснований на тому, що усі макромолекули мають певний електричний заряд, і коли через гель, де вони містяться, пропускають електричний струм, ділянки ДНК починають рухатись. Чим менший розмір молекул, тим швидше вони рухаються. Поступове вихідний препарат, який складався з різних макромолекул, розподіляється на зони. Для контролю відносної молекулярної маси розподілених фрагментів, одночасно здійснюють електрофорез маркерних молекул з відомою молекулярною масою. Відносна молекулярна маса дволанцюгових нуклеїнових кислот вимірюється у числі пар нуклеотидів (п.н.).

Для будови рестрикційної карти, необхідно порівняти розміри фрагментів, отриманих при рестрикції окремими ферментами і при рестрикції їх сумішшю. Результат такого порівняння наведений на рис.1.

Рис.1. Картировання сайтів рестрикції

EcoR1 BamH1 EcoR1 + BamH1

 

950----

850-----

600---- 600-----

500-----

400-----

300----- 300----

 

250----

100---- 100-----

Якщо при гідролізі ДНК кожної з двох рестриктаз (EcoR1 і BamH1) утворюються три фрагменти, то у початковому фрагменті ДНК було два сайти рестрикції для кожної з використаної рестриктаз. Фрагмент розміром 300 п.н., який утворюється в результаті гідролізу EcoR1, не розщеплюється при гідролізі сумішшю EcoR1 і BamH1 на відміну від EcoR1-фрагментів 850 і 500 п.н. Тобто, два EcoR1-сайти знаходяться на відстані 300 п.н. один від одного і між ними нема BamH1–сайту, а у EcoR1-фрагментах довжиною 850 і 500 п.н. є по одному BamH1-сайту. Фрагмент BamH1-сайту довжиною 950 п.н. розщеплюється EcoR1 на три фрагменти (250+300+400=950 п.н.). Таким чином, два BamH1-сайти знаходяться на відстані 250 і 400 п.н. по різні боки від сайтів для EcoR1. BamH1 розщеплює EcoR1-фрагмент довжиною 850 п.н. на фрагменти довжиною 250 і 600 п.н., а один з сайтів для EcoR1 знаходиться на відстані 250 п.н. від сайту для BamH1, тобто, фрагмент 600 п.н. повинен містити один з кінців початкової молекули ДНК. Оскільки BamH1 розщеплює EcoR1-фрагмент довжиною 500 п.н. на дві частини розміром 100 і 400 п.н., а один з EcoR1-сайтів відділений від BamH1-сайту 400 п.н., то фрагмент довжиною 100 п.н. повинен міститься в іншому кінці початкової молекули ДНК.