Лабораторного заняття № 6 з дисципліни «Генетична інженерія»

1. Тема заняття: «Вектори для будови рекомбінантних ДНК»

2. Мета проведення заняття: вивчити вектори для будови рекомбінантних ДНК.

 

2.1 Після виконаної роботи студент повинен

знати: Які молекули ДНК називають векторами, типи векторів, функція у векторі маркерного гена, вимоги надають до векторів, умови процесу кон’югації.

вміти:виявляти нові властивості маркерних генів, шляхи перенесення чужорідної інформації у клітину-реципієнт, відрізняюти кон’югативні плазміди від некон’югативних.

3.План семінарського заняття:

Введення у клітину і наступна стабільна підтримка генетичної інформації, що міститься у рекомбінантних молекулах ДНК, досягається за допомогою векторних молекул, або векторів. Справа у тому, що при звичайному введенні ДНК, наприклад, у бактеріальну клітину вона, як правило, піддається атаці ферментів, які розкладають її на складові компоненти – нуклеотиди. В деяких випадках ДНК «виживає» у клітині, однак в процесі розподілу клітин вона не успадковується і втрачається. Для того, щоб рекомбінантна ДНК стала складовою частиною генетичного апарату клітини, вона повинна або вбудуватися в її геном (інтегруватися у хромосому) і реплікуваться за його рахунок, або бути здатною до автономної реплікації. Векторами називають молекули ДНК, які здатні акцептувати (включати в себе) чужорідну ДНК і забезпечувати її реплікацію, експресію і/або трансформацію (переніс у інші організми). Таким чином, вектор дозволяє здійснити введення у клітину додаткової генетичної інформації. В якості векторів використовують, як правило, плазміди, бактеріофаги, мобільні елементи, віруси тварин.

Для конструювання векторів в генної інженерії використовують хромосоми вірусів, фрагменти хромосом еукаріотичних клітин, а також невеликі молекули нуклеїнових кислот, здатних до автономної реплікації в бактеріальних і еукаріотичних клітинах – плазміди.

За допомогою плазмідних векторів можна клонувати фрагменти ДНК довжиною до 10 т.п.н. Однак при створенні геномних бібліотек часто доводиться працювати із більшими фрагментами. Для цього розроблено вектори на основі бактеріофага λ E. coli.

Після проникнення фагу λ у клітину E. coli події можуть розвиватися по двох сценаріях. Якщо реалізується літичний цикл, то фаг починає інтенсивно розмножуватися й приблизно через 20 хв клітина руйнується (лізує) з вивільненням до 100 нових фагових часток. При альтернативному варіанті розвитку подій фагова ДНК включається в хромосому Е. coli як профаг і реплікується в клітині разом із нормальними бактеріальними генами. Однак, при нестачі живильних речовин або інших несприятливих обставин інтегрована фагова ДНК вивільнюється, і запускається літичний цикл розвитку. Розмір ДНК фага λ становить близько 50 т.п.н., причому значна її частина (близько 20 т.п.н.) несуттєва для розмноження фага й відповідає за його вбудовування в ДНК власника. У зв'язку із цим виникла ідея, що її можна замінити фрагментом іншої ДНК еквівалентного розміру.

Рекомбінантна молекула, що створюється, буде реплікуватися у клітині як ДНК рекомбінантного фага λ, що встав на літичний шлях розвитку.

Фагові вектори дозволяють клонувати фрагменти ДНК довжиною 15– 25 т.п.н. Однак, цього явно недостатньо, щоб клонувати цілком багато генів тварин і рослин, довжина яких найчастіше перевищує 35–40 т.п.н.

Необхідною місткістю володіють векторні молекули, називані космідами. Косміди являють собою невеликі плазміди у які in vitro введені cos-сайти ДНК фага λ. Звідси відбувається назва всього типу даних векторів (cosmid). У ДНК нормальних фагових часток cos-сайти розташовані на кінцях молекул, вони розділяють мономери фагової ДНК. У процесі пакування cos-сайти упізнаються компонентами ферментативної системи й по них відбувається послідовне відокремлення (відрізання) упакованої у фагову часточку λ -ДНК від іншої не упакованої ДНК.