Функциональный тест на аллелизм

 

На явлении доминирования, а также на том, что доминантными обычно (но не всегда) оказываются аллели дикого типа, а нефункциональные аллели оказываются рецессивными, основан так называемый функциональный тест на аллелизм, который как раз позволяет определить, принадлежат ли мутантные аллели одному локусу или нет. Он был предложен Томасом Морганом, когда тот еще разделял теорию присутствия-отсутствия, поэтому первоначально с помощью этого теста предполагалось определять не только принадлежность аллелей одному локусу, но и их идентичность.

Функциональный тест на аллелизм (тест на комплементарность, транс тест) заключается в получении гибридов (гетерокарионов), у которых две исследуемые мутации находятся на разных гомологичных хромосомах (транс-положение), и анализе их фенотипа. Если обе мутации действуют на разные независимые функции (затрагивают два разных гена), то такой гибрид имеет дикий фенотип, так как образуется дигетерозигота, в которой нормальные аллели доминируют над мутантными. Если исследуемые мутации действуют на одну и ту же функцию (повреждают один и тот же ген), то гибрид должен иметь мутантный фенотип. Этот простой функциональный критерий аллелизма, предложенный в 20-х годах XX века Т. Морганом, усложняется в случаях межгенной некомплементарности и межаллельной комплементации. Цис-тест заключается в получении гибридов (гетерокарионов), у которых обе исследуемые мутации привнесены одним из родителей, тогда как в хромосомах других содержатся нормальные аллели. Очевидно, что гибриды с цис-положением мутаций должны иметь фенотип дикого типа независимо от того, относятся ли исследуемые мутации к одному или разным генам. Это одна из причин редкого использования цис-теста. Другая причина — трудность получения цис-положения мутаций в случае их тесного сцепления. Однако этот тест совершенно необходим для выявления цис-доминантных мутаций в оперонах. С. Бензер в 1957 году предложил назвать генетическую единицу функции, выявляемую с помощью цис-транс-теста, цистроном. Термин «цистрон», являющийся синонимом термина «ген», используют в литературе редко.

Допустим, мы получили рецессивную мутацию с неким фенотипом, который похож на фенотип уже известной нами мутации. Воспользуемся упомянутым выше примером с белыми цветами гороха. Дикий тип окраски цветков у гороха – пурпурный. Со времен Менделя известен горох с белыми цветками, в которых отсутствует антоциан. Соответствующий этому фенотипу аллель а – рецессивен, то есть ген, каким-то образом участвующий в метаболизме антоциана – сломан, представляет собой нуль-аллель. В свое время мы обработали семена гороха химическим мутагеном и получили возникшую de novo рецессивную мутацию, также дающую в гомозиготе белые цветы. Чтобы узнать, мутация произошла в локусе a или в каком-то другом локусе необходимо скрестить гомозиготы по одной и второй. Если они имели место в одном и том же локусе, то такая гетерозигота от одного родителя получит один дефектный аллель, от второго – другой дефектный аллель, но не получит ни одной функциональной копии гена. В результате ее цветы будут белыми. Если же эти мутации произошли в разных локусах, ответственных за разные этапы синтеза антоциана, то у полученного гибрида в каждом локусе будет по одной аллели дикого типа с ненарушенной молекулярной функцией, который доминирует над дефектным и «спасет» соответствующий этап жизнедеятельности клетки. Такой гибрид будет иметь нормальный фенотип.

Бидл и Тейтам работали с ауксотрофными мутантами нейроспоры – это были мутанты, неспособные самостоятельно синтезировать какое-то необходимое в организме вещество, в норме синтезируемое. Для того, чтобы таких мутантов можно было выращивать, эти вещества необходимо добавлять в среду. Это очень удобно – мутантный штамм можно идентифицировать как не растущий на минимальной среде, поддерживать на полной среде и выяснять каким именно дефектом он обладает в опытах со средами, куда добавлены те или иные вещества. Основной вывод исследований Бидла и Тейтама был такой – мутанты, дефектные в отношении синтеза одного и того же биохимического процесса всегда оказывались аллелями одного локуса. Следовательно, каждый локус ответственен за один биохимический процесс. Поскольку каждый биохимический процесс осуществляется одним ферментом, то нормальный аллель каждого локуса неким образом и определяет этот фермент. Структура ДНК тогда не была известна, доказательство того, что именно она является носителем наследственности, было получено двенадцатью годами позже, но понятие локус уже существовало – генетика работала с виртуальным носителем информации.

Проверить аллельность разных мутантов нейроспоры по одному и тому же ферменту получением гетерозиготы нельзя, т.к. мы не можем здесь ее получить и определить ее фенотип. У нейроспоры только аскогенный гиф и аска, у которых вообще нет интересующего нас фенотипа в отношении обмена веществ, поскольку они получают все готовое от гаплоидного мицелия.

Здесь и следует скрестить их попарно. В случае аллельных мутаций мы никогда не получим восстановления нормального фенотипа, потому что в опыте вообще не фигурирует нормальный аллель. А в случае неаллельных мутаций у нас второй партнер скрещивания всегда несет нормальный аллель. Подсчитаем вероятность возникновения нормального потомства, если неаллельные мутанты находятся на разных хромосомах. На стадии редукционного деления определяется – получит ли потомство нормальный аллель. По каждому локусу в каждую клетку нормальный аллель попадет с вероятностью 1/2, вероятность сложного события, состоящего в том, что это случится для обоих локусов, есть произведение 1/2 х 1/2 = 1/4.

Так же приходится поступать и если у нас есть две доминантные (над аллелем дикого типа) мутации с одинаковым фенотипическим проявлением. В этом случае тест на аллелизм также усложняется, поскольку гибрид гомозигот по каждой из них в любом случае будет иметь соответствующий доминантный фенотип. Если обе доминантные мутации аллельны, то у такого гибрида не будет рецессивных аллелей дикого типа, и все его потомство будет иметь доминантный фенотип. Если они неаллельны, то есть принадлежат к разным локусам, то у каждого из родителей один из двух локусов будет гомозиготен по нормальному аллелю, и эти нормальные аллели проявятся в потомстве. Восстановление дикого типа при скрещивании двух гомозигот по неаллельным генам называется комплементацией – то есть гены родителей как бы дополняют друг друга с восстановлением всех функций у гибрида.

 

Таблица 1.