Молекулярная цитогенетика
Молекулярно-цитогенетические методы, в основе которых лежит использование различных ДНК-зондов и методология гибридизации in situ являются довольно перспективными для диагностики большинства хромосомных нарушений, таких как сбалансированные и несбалансированные транслокации, дополнительные маркерные хромосомы неизвестной природы, дицентрические хромосомы, некоторые варианты микродупликаций, микроделеций и инсерций. Кроме того, методы молекулярной цитогенетики могут использоваться для уточнения степени мозаицизма или установления небольшого аномального клона клеток, не улавливаемого обычным цитогенетическим исследованием. Установленная с помощью молекулярно-цитогенетических методов тонкая структура хромосомной перестройки является необходимым условием для описания новых и уточнения уже существующих хромосомных синдромов.
Флюоресцентная гибридизация in situ (англ. - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH) Представляет собой реакцию гибридизации специфических ДНК-зондовна те или иные известные участки генома с ДНК хромосом исследуемого индивида. В основе этой реакции лежит феномен комплиментарного спаривания азотистых оснований ДНК. В качестве ДНК-зондов выступают любые клонированные последовательности ДНК, выделенные фрагменты ДНК, целые хромосомы и их участки, отдельные гены и т.д. Для обнаружения (детекции) ДНК-зонда перед проведением гибридизации в его состав вводят специфические «метки» (молекулы), которые маркируют данный зонд и позволяют увидеть его непосредственно на исследуемых хромосомах (in situ).
Исторически первым методом гибридизации in situ был радиоактивный вариант детекции (1969), впоследствии модифицированный в неизотопный - флюоресцентный (1986). При флюоресцентной гибридизации in situ ДНК-зонды «метят» двумя способами: 1) ДНК-зонд метится непосредственно флюоресцирующими репортерными молекулами, конъюгированными с нуклеотидами (прямая детекция); 2) Сначала ДНК-зонды метятся репортерными молекулами (биотин, дигоксигенин), которые затем «узнаются» с помощью других соединений (например, авидином) или антител, коньюгированных с флюорохромами (например, родамином) (непрямая детекция). ДНК-зондов проводится чаще всего в ходе реакции ник-трансляции, заключающейся во внесении одноцепочных разрывов («ников») в молекулу ДНК с последующим восстановлением ее структуры за счет имеющихся в реакционной смеси свободных нуклеотидов, в том числе и коньюгированных с репортерными молекулами. В настоящее время разработаны и другие способы мечения ДНК-зондов.
FISH-анализ проводят на цитологических препаратах с метафазными хромосомами или интерфазными ядрами любых клеток организма.Для этого пригодны любые клетки организма, но наиболее часто используются лимфоциты периферической крови, клетки буккального эпителия, фибробласты кожи, клетки ворсин хориона и амниотической жидкости.
Основные этапы FISH-анализа включают:
1. Прегибридизация. Обработка цитологических препаратов РНК-азой и пепсином;
2. Денатурация анализируемой двухцепочечной ДНК на одноцепочечньге молекулы в 70% формамиде;
4. Гибридизация с ДНК-зондом; Отмывка неспецифически связанного ДНК-зонда с препаратов в 50% формамиде;
5.Детекция: прямая или непрямая. Для непрямой детекции проводят последовательную обработку препарата соединениями или антителами, коньюгированными ссоответствующими флюорохромами.
Метод позволяет проанализировать числовые аномалии хромосом в метафазных и интерфазных клетках (особенно для выявления небольших по численности клеточных клонов; исследование процессов мутагенеза), их структурные нарушения, уточнить происхождение сложных комплексных структурных перестроек хромосом и картировать гены.
Типы ДНК-зондов и область их применения:
1. Центромероспецифичные ДНК-зонды.Это клонированные в составе какого-либо вектора (например, бактериальной плазмиды) фрагменты ДНК, содержащие высокоповторяющиеся последовательности нуклеотидов в центромерном или прицентромерном гетерохроматине, но обладающие полной или относительной специфичностью к центромерным районам определенных хромосом. При полной специфичности таких ДНК-зондов они связываются с центромерным районом только одной хромосомы, а относительно специфические ДНК-зонды связываются с центромерными районами двух или более хромосом. Применяются для анализа числовых нарушений хромосом в метафазных и интерфазных клетках, исследования происхождения маркерных хромосом, анализа хромосомного мозаицизма, определения пола плода.
2. Теломерные ДНК-зонды. Это клонированные фрагменты ДНК, содержащие последовательности нуклеотидов, специфичные к теломерным районам определенных хромосом. Применяются для анализа структурных нарушений хромосом (особенно скрытых микроделеций) в терминальных районах короткого или длинного плеча конкретной хромосомы.
3. Хромосомоспецифичные ДНК-библиотеки.Это совокупность уникальных последовательностей ДНК, покрывающих всю длину определенной хромосомы. Такие ДНК-зонды, полностью окрашивающие индивидуальную хромосому после проведения процедуры гибридизации и детекции, получили название "painting''-пробы. Применяются для идентификации целых хромосом или их фрагментов в исследуемых метафазных пластинках, при исследовании происхождения сложных транслокаций, дупликаций, инсерций и маркерных хромосом.
4. Уникальные ДНК-зонды. Это клонированные уникальные последовательности ДНК, строго специфичные для определенных районов хромосом или отдельных генов. Применяются для исследования синдромов, связанных с микроструктурными перестройками хромосом и для целей картирования генов.
Модификации FISH-метода:
1. Супрессионная гибридизация in situ(англ. - Chromosomal In Situ Supression - CISS).Принцип CISS-анализа заключается в использовании для гибридизации меченых репортерной молекулой (например биотином) набор хромосомоспецифических ДНК-проб, маркирующих всю длину анализируемой хромосомы, вместе с избытком немеченой высокоповторяющейся конкурирующей ДНК. Диспергированные повторяющиеся последовательности, локализованные в ДНК-пробах, быстро гибридизуются с конкурирующей ДНК (супрессируются), в то время как уникальные последовательности остаются однонитчатыми и поэтому не теряют способности гибридизоваться в дальнейшем с соответствующей хромосомой. Эти меченные уникальные последовательности ДНК детектируются на хромосомах с помощью коньюгированных с флюорохромом молекул. Область применения соответствует области использования "painting''-проб.
2. Синтез ДНК in situ с помощью олигонуклеотидных праймеров(англ. - Oligonucleotide Primed In Situ DNA Synthesis - PRINS).Метод заключается в амплификации ДНК in vitro непосредственно на цитологических препаратах с использованием олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих исследуемый фрагмент ДНК. Эта технология позволяет проводить быструю идентификацию хромосом на цитологических препаратах за счет амплификации высококопийных хромосомоспецифичных семейств повторяющихся последовательностей ДНК с использованием флюоресцентно меченых нуклеотидов. Современные модификации PRINS-анализа дают возможность идентифицировать и уникальные гены.
3. Мультицветная FISH.Это технология окрашивания в одной метафазе разных участков хромосом или нескольких пар гомологичных хромосом разными цветами. Заключается в одновременном использовании в рамках одной реакции гибридизации in situ нескольких ДНК-зондов, меченных разными репортерными молекулами или нуклеотидами, конъюгированными с разными флюорохромами. В последние годы новые технологии позволяют окрашивать каждую из 23 пар хромосом в индивидуальный цвет. Наиболее часто для мечения используют всего 5 флюорохромов (Су5, DEAC, FITC. Spectrum Orange, Texas Red) или их комбинации друг с другом. При проведении детекции ее осуществляют с помощью флюоресцентного микроскопа и компьютерных программ, которые производят наложение полученных изображений для каждого отдельного флюорохрома в единое изображение.
Технология спектрального кариотипирования (SKY - Spectral Kariotyping) имеет много общего с мультицветным FISH анализом. Мечение полной геномной библиотеки также осуществляется с использованием комбинаций пяти флюорохромов. Однако детекция гибридизационных сигналов проводится с помощью интерферометра, который позволяет анализировать соотношение интенсивности свечения всех пяти флюорохромов сразу., в то время как при мультицветной FISH проводится последовательный анализ каждого флюорохрома.
C.O.B.R.A. (Combined Binary RAtio labelling). Принцип метода заключается в использовании специальных комплексов из трех флюорохромов для мечения хромосомной библиотеки. Допустим, что имеется комплекс из трех флюорохромов - А, В и С. Для мечения каждой индивидуальной хромосомы выбирается одна из комбинаций двух любых флюорохромов, отличающихся по соотношению их концентраций. Так, например, хромосома 1 может быть маркирована смесью 25%А+75%В, хромосома 2 - 50%А и 50%С и т.д. Соотношение концентраций двух флюорохромов, используемых для ник-трансляции, выбирается как 0%:100%; 25%:75%; 50%:50%; 75%:25%; 100%:0%. Каждое из этих пяти сочетаний обусловливает возможность получения пяти различных цветов, следовательно, один комплекс из трех флюорохромов обеспечивает индивидуальную окраску 12 хромосом, а для идентификации всех хромосом набора требуется два набора флюорохромов.
Применение мультицветной FISH:
A.Клиническое применение:
• медицинская генетика (детекция числовых и структурных хромосомных аномалий, идентификация маркерных хромосом);
• онкология (идентификация происхождения неопластических клеток, анализ клеток костного мозга после его пересадки, мониторинг эффектов лечения, обнаружение раннего рецидива рака, установление хромосомных перестроек в области локализации протоонкогенов и антионкогенов в неделящихся или интерфазных клетках, детекция амплификации генов при некоторых неопластических процессах).
B. Использование в научных исследованиях:
• молекулярно-цитогенетический анализ хромосомных аномалий в опухолевых тканях и их эволюция при прогрессии опухоли;
• мультиплексная локализация генов и последовательностей ДНК на хромосомах, построение физических карт;
• детекция амплификации генов;
• детекция вирусных последовательностей и мобильных генетических элементов в ДНК;
• филогенетические исследования;
• анализ механизмов формирования хромосомных аномалий;
• анализ процессинга и транспорта РНК, количественная и качественная оценка мРНК или белков на клеточном уровне;
• анализ хромосомных аберраций в генетической токсикологии.
4. «Обратная» гибридизация (reverse painting).Метод направлен на
установление происхождения маркерных хромосом и фрагментов хромосом, вовлеченных в структурные перестройки.
«Обратная» гибридизация проводится в несколько этапов:
а) изоляция маркерной хромосомы или фрагмента аберрантной хромосомы с помощью микродиссекции или проточной сортировки хромосом;
б) амплификация и мечение ДНК изолированного фрагмента – получение ДНК-зонда на основе библиотеки маркерной хромосомы или фрагмента;
в) гибридизация полученного ДНК-зонда на метафазной пластинке с нормальным кариотипом и идентификация локализаций сайтов гибридизационных сигналов.
5. Гибридизация в условиях различной жесткости.Метод направлен на быстрый и экономичный анализ хромосомных аберраций и основан на уникальной особенности организации a-сателлитных последовательностей ДНК в разных хромосомах человека. В зависимости от числа мономеров, образующих повторяющуюся единицу, альфоидная ДНК подразделяется на несколько субсемейств, локализованных на различных группах хромосом. При гибридизации в условиях «низкой жесткости» определенные ДНК-зонды связываются с группой хромосом одного а-сателлитного субсемейства. Проведение последующей гибридизации в условиях «высокой жесткости» с хро-мосомоспецифичными ДНК-зондами одной группы обеспечивает точную идентификацию аномальной хромосомы.
6. Сравнительная геномная гибридизация(англ. Comparative Genomic Hybridization - CGH).Одновременно проводят гибридизацию in situ двух различных меченных ДНК, одна из которых выделена из анализируемой ткани и мечена одним флюорохромом или репортерными молекулами, а другая из кариотипически нормальной ткани и мечена другим флюорохромом. При проведении гибридизации анализируемая и референсная ДНК смешиваются в соотношении 1:1 и с добавлением избытка не меченной высокоповторяющейся Cot-1 ДНК наносятся на препараты с нормальными метафазными хромосомами. При наличии хромосомного дисбаланса в анализируемой ткани на препарате изменяется соотношение интенсивности свечения флюорохромов: при делеции фрагмента ДНК свечение в анализируемом участке будет сдвинуто в ту область спектра, которая характерна для флюорохрома, маркирующего нормальную ДНК. Напротив, при амплификации ДНК свечение смещается в область, характерную для анализируемой ДНК. Данный метод не требует проведения кариотипического анализа изучаемой ткани, поэтому имеет большую ценность при проведении исследования генетической структуры тканей, для которых существуют трудности в получении метафазных хромосом для анализа (например, солидные опухоли).
Применение CGH:
• цитогенетика опухолей; анализ гетерогенности клеточной популяции при раке; анализ опухолевой прогрессии;
• исследование фено-кариотипических корреляций;
• детекция амплификации и делеции генов; локализация кандидатных генов;
• скрининг структурных хромосомных аберраций;
• анализ интеграции вирусов и мобильных генетических элементов в геном.
7. Методы цветного сегментирования хромосом.Методы основаны
на использовании библиотек регион-специфичных ДНК-проб (РСР), меченных различными флюорохромами. Полная разрешающая способность достигает 500 сегментов на гаплоидный набор хромосом.
Применение методов:
• анализ тонких структурных аберраций хромосом; идентификация микроделеций;
• изучение эволюции хромосом в пределах таксономических групп организмов (межвидовое цветное сегментирование хромосом).
8. Fiber-FISH.Данный метод представляет собой вариант флуоресцентной гибридизации in situ, проводимой на фибриллах ДНК, которые формируются на цитологических препаратах в свободном состоянии после обработки
последних специфическими реагентами. Fiber-FISH обладает наивысшей разрешающей способностью из всех вариантов метода гибридизации in situ и позволяет идентифицировать последовательности ДНК протяженностью 1-150 килодальтон.
Применение метода:
• диагностика синдромов с микроаномалиями хромосом;
• анализ тонких внутрихромосомных аномалий;
• картирование генов путем непосредственного визуального определения порядка расположения отдельных участков ДНК в хромосоме относительно друг друга;
• анализ феномена экспансии нуклеотидных повторов.