МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Микробиологические исследования являются обязательными при постановке диагноза туберкулеза любой локализации. При активном выявлении случаев заболевания они применяются для верификации диагноза и при невозможности провести обследование больного лучевыми методами (например: постельный больной или отказ от обследования в других условиях). Основное условие проведения — наличие патологического диагностического материала, т.е. например, при легочных формах туберкулеза - мокроты.
Бактериоскопическое исследование(микроскопия) — первый, наиболее быстрый, простой и дешевый метод выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМЕ), к которым относятся и микобактерии туберкулеза (МЕТ). Он позволяет обнаружить микобактерии при содержании их менее 10000 микробных тел в 1 мл материала. Тем не менее, микроскопия остается одним из основных диагностических исследований на первичных этапах обследования больных. Преимущество бактериоскопии заключается в быстроте получения результата (от 1 часа) и относительной простоте исследования. Для получения достоверного результата исследования мазка диагностическогоматериала лаборант обязан просмотреть 100 полей зрения,и только тогда, не обнаружив КУМБ, он имеет право дать отрицательный ответ.
Культуральный метод (посев) позволяет выявлять микобактерии туберкулеза при наличиив исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных особей возбудителя. Это особенно важно при исследовании олигобациллярного диагностического материала от впервые выявленных или уже леченых больных, выделяющих малое количество микобактерий. Недостатки метода: необходимость в специализированной лаборатории, квалифицированном персонале, длительное время инкубации (от трех недель до трех месяцев).
Первичное бактериоскопическое обследование осуществляется всеми лечебно-профилактичсскими учреждениямивходит в диагностический минимум. Наданном этапе выявляется наиболее эпидемически опасная категория пациентов.
Целью данного этапа является определение наличия/отсутствия кислотоустойчивых микобактерий в мокроте или другом диагностическом материале методом прямой микроскопии среди лиц с подозрением на туберкулез по клиническим и/или рентгенологическим симптомам. К ним относятся:
1. обратившиеся за медицинской помощью с респираторными жалобами или симптомами интоксикации, характерными для туберкулеза (выявление по обращаемости);
2. лица с изменениями, выявленными лучевыми методами или входящие в группы риска по заболеванию туберкулезом (активное выявление).
3. привлеченные к обследованию (активное выявление) по результатам применения клинического метода;
4. больные, находящиеся под наблюдением врачей узких специальностей по поводу ряда хронических заболеваний (активное выявление).
При положительных или сомнительных результатах первичного обследования, а также при отрицательных, но с наличием клинико-рентгенологических симптомов, пациент направляется в специализированное противотуберкулезное учреждение для подтверждения или исключения диагноза туберкулеза более совершенными диагностическими методами.
Противопоказаний к применениюметода нет. Однако следует помнить, что результаты бактериоскопии не могут быть единственнымоснованием при постановке клинического диагноза.
Для исследования на туберкулез используется разнообразный материал. При легочных процессахчаще всего исследуют следующие материалы: мокроту; отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозольной (раздражающей) ингаляции; промывные воды бронхов; бронхоальвеолярные смывы; материал, получаемый при бронхоскопии, транстрахеальной и внутрилегочной биопсии; аспират из бронхов; мазки из гортани; экссудаты; промывные воды желудка (преимущественно у детей).
Мокрота.Сбор мокроты для исследования на кислотоустойчивые микобактерии весьма ответственный этап диагностической процедуры, от четкости проведения которого во многом зависит результат исследования.
Вмокроте больных туберкулезом органов дыхания (особенно при наличии у них полостей распада легочной ткани) хотя обычно и содержится значительное количество МБТ, однако бактериовыделение не всегда регулярно, и это требует определенной тактики сбора материала. Чувствительность метода напрямую зависит от кратности обследования пациента: при однократном исследовании — 80-83%, двукратном — на 10-14% больше и при исследовании трех проб мокроты — еще на 5-8%больше. Таким образом, приподозрении на туберкулез органов дыхания необходимо исследовать не менее трех проб мокроты. Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте пациента может содержаться меньше микобактерий, чем может выявить микроскопическое исследование.
Для аэрозольных ингаляцийпользуются портативными или стационарными аэрозольными ингаляторами, рекомендуется использовать раствор, в 1 л которого содержится 150 гхлорида натрия (NaС1) и 10 г бикарбоната натрия (Na₂СО₃). В целях предотвращения загрязнения раствора кислотоустойчивыми сапрофитами для приготовления раствора используется стерильная дистиллированная вода. Для провокации выделения мокроты необходимо вдохнуть от 30 до 60 мл подогретого до 42-45 °С раствора в течение не менее 10-15 минут. Так как вдыхаемый во время процедуры ингаляции раствор вызывает усиленную саливацию еще до появления кашля и отделения мокроты, в первые минуты после завершения процедуры пациент должен сплюнуть слюну в специально приготовленный лоток с 5% раствором хлорамина или другого дезинфицирующего средства и только после этого собрать мокроту для исследования.
У большинства пациентов после аэрозольной ингаляции в течение нескольких часов наблюдается остаточная гиперсекреция бронхиального содержимого, поэтому пациенту рекомендуется в течение суток после ингаляции собрать мокроту для второго исследования.
Промывные воды бронхов.Сбор промывных вод бронхов рекомендуется производить врачом-отоларингологом, поэтому эта процедура доступна только в тех медицинских учреждениях, в которых имеется такой специалист. Пациенту во время вдоха вводят шприцем в трахею 5-7 мл стерильного изотонического раствора, который вызывает кашлевой рефлекс. При этом вместе с изотоническим раствором может откашливаться секрет из глубоких отделов бронхиального дерева. Промывные воды бронхов собирают в стерильный флакон и немедленно направляют в лабораторию. Пациентам с выраженным глоточным рефлексом указанную процедуру производят после предварительной анестезии надгортанника, гортани и задней стенки глотки.
Более информативным материалом для исследования является материал, получаемый при бронхологических исследованиях: аспират из трахеии дренирующих бронхов, броихоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ), атакже материалы прицельной катетер- и щеточной биопсии.
Промывные воды желудкаисследуют преимущественно удетей младшего возраста, которые плохо откашливают мокроту и часто проглатывают ее. Во избежание смешивания проглоченной мокроты с пищей промывные воды желудка следует брать натощак. Последний прием пищи должен быть не менее чем за 12 часов до взятия промывных вод желудка. Перед забором материала для нейтрализации желудочного содержимого пациенту дают выпить 100-150 мл раствора питьевой соды (1 чайная ложка питьевой соды на 1 стакан воды). Раствор приготавливается на стерильной дистиллированной воде. После этого вводят желудочный зонд и собирают содержимое желудка в стерильный флакон. Материал немедленно доставляют в лабораторию и подвергают обработке, чтобы исключить повреждающее влияние на возбудителя содержащихся в материале желудочных ферментов.
Особенно результативен метод получения промывных вод желудка в сочетании с предварительной аэрозольной ингаляцией. Промывные воды желудка следует забирать через 30 мин. после аэрозольной ингаляции. Такая комбинация двух указанных методов позволяет получать значительно больший процент положительных результатов, чем каждый из них в отдельности. Этот метод получения диагностического материала может оказаться полезным также у пациентов с подавленным кашлевым рефлексом, у которых не удается получить материал даже при провоцирующих ингаляциях.
При внелегочных формах заболеваниямикобактерии могут поражать практически любой орган, поэтому для исследования пригоден самый разнообразный материал: различные тканевые жидкости (спинномозговая, плевральная, перикардиальная, синовиальная, асцитическая, кровь, гной), пунктаты костного мозга, резецированные ткани того или иного органа, полученные при биопсиях или оперативных вмешательствах, гнойно-некротические массы, грануляции, соскобы синовиальных оболочек, лимфатические узлы или пунктаты их содержимого.
Специальных навыков, дополнительного оборудования для забора и исследования диагностического материала не требуется. Методика должна использоваться во всех лечебно-профилактических учреждениях, имеющих в своем составе клиническую лабораторию, однако при возможности следует организовать доставку материала в бактериологическую лабораторию или направить больного в диспансерное отделение областного противотуберкулезного диспансера для консультации специалиста по внелегочному туберкулезу.
При внелегочных формах процесса исследуется как асептически полученный материал, свободный от загрязняющей сопутствующей микрофлоры, так и заведомо загрязненный материализ открытых очагов поражения, в отношении которого заранее известно, что он контаминирован сопутствующей микробной флорой или собран без соблюдения правил асептики.
Асептически собранный тканевый материалчаще всего состоит из полученной при биопсиях или оперативных вмешательствах резецированной ткани того или иного органа, гнойно-некротических масс, грануляций, соскобов синовиальных оболочек, лимфатических узлов или пунктатов их содержимого. Материал помещается в стерильный флакон без консервантов и немедленно доставляется в лабораторию. Если материал не может быть немедленно доставлен в лабораторию, во избежание высыхания к нему добавляется небольшое количество стерильного изотонического раствора, и он помещается в холодильник при 4-10°С или во флакон с сухим льдом.
Заведомо загрязненные материалы.К этой категории относится большинство ниже перечисленных материалов, а также основной и наиболее доступный при мочеполовом туберкулезе материал — моча.
Моча(средняя часть утренней порции или вся утренняя порция) собирается в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Анализ мочи на микобактерии должен предусматривать обязательное троекратное исследование. В лаборатории мочу центрифугируют, используя метод накопления осадка. Особенностью существования МБТ в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000 всего материала, а не его донной фракции, получаемой после отстаивания в естественных условиях.
Сбор суточной мочи для бактериологического исследования не практикуется. Это объясняется тем, что при накоплении мочи в течение суток невозможно сохранить ее стерильность и т.д.
Менструальная кровь.Исследование менструальной крови требует особого методического подхода. Наличие в этом материале большого количества протеолитических, фибринолитических и других ферментов обусловливает необходимость незамедлительной доставки материала в лабораторию и тщательной его обработки, так как менструальная кровь, с одной стороны, материалом для развития вторичной флоры, а с другой благодаря обилию ферментов, неблагоприятно влияет на жизнеспособность микобактерий. Менструальную кровь следует собирать не тампоном, а вакуумным отсосом или колпачком Кафки. Исследуют ее так же, как кровь или другие материалы с примесью крови.
Если у больного заподозрена внелегочяая форма туберкулеза, помимо других видов диагностического материала желательно также исследовать имокроту, так как это существенно повышает частоту выявления сочетанных легочных и внелегочных форм туберкулеза.
Режимы, кратность, методика сбора мокроты.
При исследовании мокроты пациентов с подозрением на туберкулез понятие «качественная мокрота» имеет конкретное определение. Качественной является свежевыделенная мокрота из глубоких отделов дыхательных путей с минимальными примесями слюны или носоглоточной слизи. Наилучшим для исследования считают образец мокроты, в котором имеются слизистые или слизисто-гнойные комочки, белесоватые включения. Сероватый, желтоватый или бурый цвет мокроты также может характеризовать качественный материал. Для исследования достаточно 3-5 мл мокроты, но хорошие результаты могут быть получены и при исследовании меньших объемов мокроты.
При первом обращении больного к врачу с симптомами, подозрительными на туберкулез, необходимо в течение 2-3 дней исследовать не менее З порций мокроты, собранных под наблюдением медицинского персонала.
Для того чтобы уменьшить число ежедневных визитов пациента в медицинское учреждение для посещения врача и сдачи 3 утренних проб мокроты (это потребует 3-4 последовательных визита), практикуется следующая тактика.
Первую пробу мокроты пациент собирает при первом посещении медицинского учреждения под непосредственным наблюдением медицинского работника (см. ниже). По завершении процедуры сбора мокроты пациент получает стерильный флакон для сбора мокроты на следующий день. Одновременно медицинский работник, ответственный за сбор материала, объясняет пациенту необходимость сбора мокроты и правила ее сбора в домашних условиях.
Вторую пробу пациенту предлагается собирать самостоятельно утром следующего дня и доставить ее в лабораторию.
Третья проба собирается под наблюдением медицинского работника в день второго посещения после сдачи второй пробы материала.
Если же пациент не выделяет мокроту или выделяет ее только эпизодически и в скудном количестве, то накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты следует дать ему отхаркивающее средство или применить раздражающие ингаляции. Последние провоцируют усиление секреции бронхов, кашель и отделение мокроты. Собранный таким образом материал не подлежит консервации, поэтому приготовление мазков из такого материала необходимо производить в день его сбора.
Результативность бактериоскопического исследования
непосредственно зависит от качества диагностического материала. В случаях, если в направлении на исследование указана мокрота, именно этот патологический материал должен быть доставлен и исследован в лаборатории. Материал в виде слюны не должен подменять мокроту.
Сбор мокроты должен производиться в присутствии и при непосредственном участии медицинского персонала.
1. Лицам, ответственным за сбор мокроты, следует объяснить пациенту причины исследования и необходимость откашливать не слюну или носоглоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей, что достигается в результате продуктивного кашля, возникающего после нескольких глубоких вдохов.
2. Необходимо предупредить пациента, что он должен предварительно почистить зубы и прополоскать полость рта кипяченой водой, что позволяет механически удалить основную часть вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатки пищи, загрязняющие мокроту и затрудняющие ее обработку.
3. Участвующий в сборе мокроты медицинский работник в маске, резиновых перчатках и резиновом фартуке должен находиться за спиной пациента, выбирал свое положение таким образом, чтобы направление движения воздуха было от него к пациенту. Медицинский работник должен открыть стерильный флакон для сбора мокроты, снять с него крышку и передать его пациенту.
4. Стоя позади пациента, следует рекомендовать ему держать флакон как можно ближе к губам и сразу же сплевывать в него мокроту по мере ее откашливания. Выделение мокроты усиливается после одного или нескольких глубоких вдохов.
5. По завершении сбора мокроты медицинский работник должен закрыть флакон крышкой, оценить количество и качество собранного материала, занести эти данные в направление. Флакон с собранной порцией мокроты тщательно закрывают завинчивающейся крышкой, маркируют и помещают в специальный бикс или ящик для транспортировки в лабораторию.
Материально-техническое обеспечение.
Материал для исследования на кислотоустойчивые микобактерии собирают в стерильные флаконы с плотно завинчивающимися крышками. При применении герметизированных флаконов предотвращается попадание МБТ во внешнюю среду, предохраняется исследуемый материал от загрязнения широко распространенными в окружающей среде кислотоустойчивыми микобактериями.
Флаконы (желательно одноразового применения) для сбора качественного диагностического материала должны быть изготовлены из ударостойкого материала, легко утилизироваться. Они должны иметь емкость 20-50 мл, удобные, плотно завинчивающиеся или герметически закрывающиеся крышки, широкое отверстие (не менее 35 мм в диаметре), чтобы пациент мог легко сплевывать мокроту внутрь флакона, не подвергая загрязнению его наружную поверхность. Для возможности оценки количества и качества собранной пробы флаконы должны быть изготовлены из прозрачного материала, легко подвергающегося маркировке и надежно сохраняющего ее на всем протяжении хранения, транспортировки и проведения исследования.
При отсутствии возможности использовать одноразовые флаконы можно применять толстостенные флаконы из стекла (карманные плевательницы многоразового пользования), которые каждый раз перед выдачей пациенту должны быть подвергнуты стерилизации.
Хранение и транспортировка диагностического материала.
Хранение материала. Если в данном медицинском учреждении не проводятся микроскопические исследования на выявление кислотоустойчивых микобактерий, собранный диагностический материал должен как можно быстрее централизованно доставляться в лабораторию. До момента отправки в лабораторию герметично закрытые флаконы с материалом хранятся в холодильнике, который по окончании каждого рабочего дня опечатывается и запирается. Срок сохранения материала в холодильнике не должен превышать 48-72 часа. При более длительном хранении необходимо применить консервирующие средства.
Наиболее приемлемые результаты достигаются при использовании одного из перечисленных ниже консервантов, которые добавляются к собранной мокроте в двукратном объеме:
— 10% водный раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия (Nа₃РО₄) — 3-5 суток;
— 0,05-0,1% раствор хлоргексидина биглюконата (ХГГ) — 3-5 суток;
— 2-3% раствор борной кислоты — до З суток.
При использовании перечисленных консервантов материал сохраняется при комнатной температуре. Однако для снижения их токсичности в отношении микобактерий пробы рекомендуется сохранять в холодильнике при температуре от 4 до 8 °С.
Транспортировка. Доставка может осуществляться немедленно, 1-2 раза в неделю при условии обязательного сохранения материала в промежутках между доставками в холодильнике или с применением консервантов.
Обычно используют один из следующих принципов централизованной доставки диагностического материала: автотранспортом лаборатории «на себя»; автотранспортом обслуживаемого учреждения «от себя». В обоих случаях должен быть составлен и согласован график транспортировки материала. Водитель машины должен быть обучен правилам обращения с инфекционным материалом, иметь флакон с дезинфицирующим средством и ватные тампоны на случай аварийной протечки материала.
Во время транспортировки материал следует предохранять от воздействия прямых солнечных лучей и тепла. Если транспортировка и хранение занимают не более 48-72 часов, материал можно пересылать без консервации. В летний период консервация необходима, если транспортировка занимает более 24 часов. Допускается пересылка материала в замороженном состоянии без консервации. Недопустимо после размораживания повторное замораживание диагностического материала, оно ведет к нарушению структуры и тинкториальных свойств МБТ.
Для транспортировки материала рекомендуется пользоваться биксами или специальными транспортировочными ящиками (контейнерами) с мягкими легко стерилизующимися прокладками на дне и с гнездами или прокладками для флаконов и/или пробирок. Во избежание протечки жидких материалов и нарушения целости флаконов они должны быть закреплены в транспортировочных ящиках в вертикальном положении и снабжены внешними прокладками, предохраняющими их от повреждения. Прокладки должны быть выполнены из материалов, обладающих высокой адсорбционной способностью с тем, чтобы в случае протечки они могли адсорбировать жидкость и ограничить участок загрязнения в пределах транспортировочного контейнера.
Мазки для микроскопического исследования транспортируются в специальных планшетах. Для предохранения от перекрестной контаминации при транспортировке они не должны касаться друг друга.
Каждая проба материала должна быть промаркирована, иметь соответствующее направление, а вся партия — заполненный сопроводительный лист. Во избежание инфицирования бланков направлений и сопроводительных документов желательно помещать их в чистый конверт или полиэтиленовый пакет и передавать непосредственно в руки водителю автотранспорта, не помешал их в транспортировочный контейнер. Категорически запрещается заворачивать флакон с материалом в бланк направления. Это необходимо объяснить больному и работнику, ответственному за сбор и транспортировку материала.
Перед отправлением транспортного средства, перевозящего материал, а также при приеме материала в лаборатории обязательна проверка следующих положений:
1. число доставленных в лабораторию флаконов с материалом должно соответствовать их числу, указанному в сопроводительном листе;
2. идентификационный номер пробы материала должен быть нанесен на этикетку или боковую поверхность контейнера с материалом не допускается нанесение маркировки на крышку флакона;
3. идентификационный номер маркировки каждого флакона с материалом должен точно соответствовать номеру, указанному в сопроводительном листе;
4. каждая проба материала должна иметь заполненный бланк Направления с указанием характера необходимого исследования;
5. каждая партия материала должна иметь сопроводительный лист, в котором должны быть указаны необходимые данные каждого пациента;
6. в сопроводительном листе должна быть указана дата, время отправки материала и подпись сотрудника, ответственного за отправку.
Сопроводительный лист составляется в 2 экземплярах: один заполненный экземпляр передается в лабораторию; другой — с подписью сотрудника, принявшего материал для исследования, возвращается в учреждение, направившее материал в лабораторию.