Постановка метода Рекалде

1. Кровь осторожно перемешивают с 6% раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция), приготовленном на физиологическом растворе из расчета: 1 объем декстрана на 5 объемов крови.

2. Кровь отстаивается в течение 30 мин (15 мин при 37 °С, затем 15 мин при комнатной температуре).

3. Осторожно собирают плазму, обогащенную лейкоцитами (лейкомасса). К полученной лейкомассе трехкратно добавляют раствор NaС1 по следующей схеме:

• 0 мин - добавляют 9% NaС1 из расчета 5 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С;

• 11-я минута - добавляют 9% NaС1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37° С;

• 21-я минута - добавляют 9% ?С1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С.

Общее время инкубации составляет 30 мин.

4. К лейкомассе добавляют равный объем раствора Хенкса, соответствующей осмомолярности, полученный путем добавления 25 мкл 9% раствора NaС1 на каждый миллилитр стандартного раствора Хенкса.

5. Немедленно проводят выделение моноцитов на гипертоническом градиенте плотности. Для этого в стандартный раствор фиколлурографина добавляют кристаллический NaС1 из расчета 2,8 мг на каждый миллилитр раствора фиколл-урографина (удельная плотность 1,078 г/см³). Конечная плотность раствора составляет 1,080 г/см³. В силиконированные пробирки на один объем гипертонического градиента осторожно наслаивают 3 объема подготовленной лейкомассы.

6. Пробирки центрифугируют в течение 25 мин при 400 g при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования моноциты концентрируются в интерфазном кольце.

7. Моноциты из интерфазы переносят в силиконированные пробирки и дважды отмывают средой 199, содержащей 5% СЭК. Режим центрифугирования - 10 мин при 200 g.

8. Клетки ресуспендируют в питательной среде RPMI-1640, содержащей 1% L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина и 10% СЭК. Количество моноцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивают с помощью 0,1% раствора трипанового синего.

ВЫДЕЛЕНИЕ НЕЙТРОФИЛОВ

Для выделения нейтрофилов из периферической крови можно использовать несколько методов.