АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ И ИЗОФЕРМЕНТОВ. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ферменты присутствуют в биологических объектах в малых концентрациях, поэтому больший интерес представляет не количественное содержание ферментов, а их активность. Принятая международная единица активности ферментов (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин в оптимальных для данного фермента условиях. В Международной системе единиц (СИ) единицей активности ферментов является катал (кат) - количество фермента, необходимое для каталитического превращения 1 моля субстрата за 1 сек.

По субстратной специфичности - способности избирательно ускорять определенную реакцию – различают:

· ферменты, обладающие абсолютной специфичностью (т.е. действующие только на одно конкретное вещество и катализирующие только определенное превращение этого вещества). К этой группе относятся, в частности, ферменты, использующие в качестве субстрата определенные стереоизомеры (например, сахара и аминокислоты L или D ряда). Нпример, уреаза, катализирующая гидролиз мочевины до NH₃ и СО₂, лактатдегидрогеназа, оксидазы D и L аминокислот.

· ферменты, обладающие относительной или групповой специфичностью (т.е. катализирующие превращения молекул, обладающих определенным сходством). Относительная специфичность характерна для многих ферментов, в т.ч. для ферментов класса гидролаз: протеаз, эстераз, фосфатаз.

Скорость катализируемых ферментами реакций зависит от ряда факторов, в первую очередь - от природы фермента, обладающего низкой или высокой активностью, а также от концентрации субстрата, наличия в среде активаторов или ингибиторов, температуры и реакции среды (рН). В определенных пределах скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата, а начиная с определенной (насыщающей) его концентрации скорость реакции не меняется с возрастанием концентрации субстрата.

Оптимальная температура для активности ферментов составляет обычно 40-50°С. При более низкой температуре скорость ферментативной реакции, как правило, снижается, а при 0°С функционирование ферментов прекращается. При превышении оптимальной температуры скорость реакции снижается, а затем реакция полностью прекращается вследствие постепенной денатурации белков и инактивации. Отдельные ферменты различаются по оптимальному для их действия значению рН. Многие ферменты наиболее активны при величине рН, близкой к нейтральной (рН около 7,0), но ряд ферментов имеет оптимум рН вне этой области. Так, пепсин наиболее активен в сильнокислой среде (рН 1,0-2,0), а трипсин - в слабощелочной (рН 8,0-9,0).

Существенное влияние на активность ферментов оказывает наличие в среде определенных химических веществ: активаторов, повышающих активность ферментов, и ингибиторов, подавляющих ее. Часто одно и то же вещество служит активатором одних ферментов и ингибитором других. Ингибирование ферментов может быть обратимым и необратимым. Определяемая в норме активность ферментов в сыворотке крови есть результат сбалансированности скорости, с которой ферменты синтезируются внутри клеток и выходят из них, со скоростью удаления ферментов из внеклеточной жидкости путем инактивации и разрушения и их экскреции.

При различных заболеваниях часто наблюдается изменение активности ферментов в биологических жидкостях. Это может быть обусловлено рядом причин. Повышение активности может быть результатом ускорения процессов синтеза (например, щелочная фосфатаза при рахите, гепатите), некроза клеток (например, креатинкиназа, аспарагиновая трансаминаза при инфаркте миокарда), понижения выведения (например, щелочная фосфатаза при закупорке желчных путей), повышения проницаемости клеточных мембран (например, аспарагиновая трансаминаза, аланинаминотрансфераза при вирусном гепатите).

Большинство ферментов функционирует в тех клетках, в которых происходит их биосинтез. Исключение составляют пищеварительные ферменты, секретируемые в пищеварительный тракт, ферменты плазмы крови, участвующие в процессе свертывания крови, и некоторые другие.

Многие ферменты характеризуются наличием изоферментов - молекулярных разновидностей ферментов. Катализируя одну и ту же реакцию, изоферменты могут различаться по ряду физико-химических свойств (по первичной структуре, субъединичному составу, оптимуму рН, термостабильности, чувствительности к активаторам и ингибиторам, сродству к субстратам и т.д.). Множественные формы ферментов включают:

· генетически детерминированные изоферменты (например, лактатдегидрогеназа)

· негенетические изоферменты, образующиеся в результате химической модификации исходного фермента или его частичного протеолиза (например, изоферменты пируваткиназы).

Различные изоформы одного фермента могут быть специфичны для разных органов и тканей или субклеточных фракций. Как правило, многие ферменты присутствуют в тканях в разных концентрациях и часто в разных изоформах, хотя известны и ферменты, специфичные для определенных органов.

Регуляция активности ферментативных реакций многообразна. Она может осуществляться за счет изменения факторов, влияющих на активность ферментов, в т.ч. рН, температуры, концентрации субстратов, активаторов и ингибиторов. Так называемые аллостерические ферменты способны в результате присоединения к их некаталитическим участкам метаболитов - активаторов и ингибиторов - изменять стерическую конфигурацию белковой молекулы (конформацию). За счет этого изменяется взаимодействие активного центра с субстратом и, следовательно, активность ферментов. Возможна регуляция активности ферментов за счет изменения количества его молекул в результате модуляции скорости его биосинтеза или деградации, а также за счет функционирования различных изоферментов.

Ферменты, которые обнаруживаются в норме в плазме или сыворотке крови, условно можно разделить на 3 группы: секреторные, индикаторные и экскреторные

Секреторные ферменты,синтезируясь в печени, в норме выделяются в плазму крови, где играют определенную физиологическую роль. Типичными представителями данной группы являются ферменты, участвующие в процессе свертывания крови, и сывороточная холинэстераза

Индикаторные (клеточные) ферментыпопадают в кровь из тканей, где они выполняют определенные внутриклеточные функции. Один из них находится главным образом в цитозоле клетки (лактатдегидрогеназа, альдолаза), другие – в митохондриях (глутаматдегидрогеназа), третьи – в лизосомах (β-глюкуронидаза, кислая фосфатаза) и т.д. Большая часть индикаторных ферментов в сыворотке крови определяется в норме лишь в следовых количествах. При поражении тех или иных тканей ферменты из клеток «вымываются» в кровь; их активность в сыворотке резко возрастает, являясь индикатором степени и глубины повреждения этих тканей.

Экскреторные ферментысинтезируются главным образом в печени (лейцинаминопептидаза, щелочная фосфатаза и др.). В физиологических условиях эти ферменты в основном выделяются с желчью. При многих патологических процессах выделение экскреторных ферментов с желчью нарушается, а активность в плазме крови повышается.

return false">ссылка скрыта

Особый интерес энзимодиагностики представляет исследование активности индикаторных ферментов в сыворотке крови, так как по появлению в плазме или сыворотке крови ряда тканевых ферментов в повышенных количествах можно судить о функциональном состоянии и поражении различных органов (например, печени, сердечной и скелетной мускулатуры). При остром инфаркте миокарда особенно важно исследовать активность креатинкиназы, АсАТ, ЛДГ и оксибутират-дегидрогеназы.

При заболеваниях печени, в частности при вирусном гепатите в сыворотке крови значительно увеличивается активность АлАТ и АсАТ, глутаматдегидрогеназы и некоторых других ферментов. Большинство ферментов, содержащихся в печени, присутствуют и в других органах. Органоспецифическими ферментамидля печени считаются также гистидаза, сорбитолдегидрогеназа, аргиназа и орнитинкарбамоилтрансфераза. Изменение активности этих ферментов в сыворотке крови свидетельствует о поражении печеночной ткани.

В настоящее время особо важным лабораторным тестом стало исследование активности изоферментов в сыворотке крови, в частности изоферментов ЛДГ. Известно, что в сердечной мышце наибольшей активностью обладают изоферменты ЛДГ₁ и ЛДГ₂, а в ткани печени – ЛДГ₄ и ЛДГ₅ . Установлено, что у больных с острым инфарктом миокарда в сыворотке крови резко повышается активность изоферментов ЛДГ₁ и отчасти ЛДГ₂. Изоферментный спектр ЛДГ в сыворотке крови при инфаркте миокарда напоминает изоферментный спектр сердечной мышцы. Напротив, при паренхиматозном гепатите в сыворотке крови значительно возрастает активность изоферментов ЛДГ₄ и ЛДГ₅ и уменьшается активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂.

Диагностическое значение имеет также исследование активности изоферментов креатинкиназы в сыворотке крови. Существуют по крайней мере 3 изофермента креатинкиназы: ВВ, ММ и MB. В мозговой ткани в основном присутствует изофермент ВВ (от англ. brain – мозг), в скелетной мускулатуре – ММ-форма (от англ. muscle – мышца). Сердце содержит гибридную МВ-форму, а также ММ-форму. Изоферменты креатинкиназы особенно важно исследовать при остром инфаркте миокарда, так как МВ-форма в значительном количестве содержится практически только в сердечной мышце. Повышение активности МВ-формы в сыворотке крови свидетельствует о поражении именно сердечной мышцы.

Уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина в крови резко увеличен при сахарном диабете, злокачественных поражениях поджелудочной железы, болезнях печени и др. Активность кислой фосфатазы (уровень повышен при карциноме предстательной железы), щелочной фосфатазы, холинэстеразы и некоторых других органоспецифических ферментов (например, гистидазы, уроканиназы, глицинамидинотрансферазы) в сыворотке крови при патологии костной ткани, печени, метастатических карциномах

Возрастание активности ферментов сыворотки крови при многих патологических процессах объясняется: выходом в кровяное русло ферментов из поврежденных участков органов или тканей на фоне продолжающегося их биосинтеза в поврежденных тканях; одновременным повышением каталитической активности некоторых ферментов, переходящих в кровь. Возможно, что повышение активности ферментов при «поломке» механизмов внутриклеточной регуляции обмена веществ связано с прекращением действия соответствующих регуляторов и ингибиторов ферментов, изменением под влиянием различных факторов строения и структуры макромолекул ферментов.

Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме крови прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени действия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных структур органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения ферментов в индивидуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.

Многие факторы, приводящие к развитию воспалительного процесса, способны повышать проницаемость мембран для белков и таким образом вызывать утечку внутриклеточных ферментов. Скорость выхода различных ферментов из поврежденных тканей неодинакова. На этот процесс воздействуют следующие факторы: концентрационный градиент, он неодинаков для различных типов клеток. Так в клетках печени содержание ЛДГ выше в 3 тысячи раз, чем вне клеток: 3000:1, а в эритроцитах этот перепад только в 200 раз внутри выше, чем в сыворотке крови. Установлено, что ферменты с высоким концентрационным градиентом быстрее уходят из клетки, чем ферменты с меньшим градиентом.

Вторым фактором, влияющим на скорость выхода ферментов из клетки, является размер форменных молекул. Более мелкие диффундируют с большей скоростью, чем крупные. И мелкие высвобождаются на ранней стадии повреждения.

Третий фактор – это внутриклеточная локализация ферментов. Легко из тканей высвобождаются ферменты цитоплазмы клетки. Выход митохондриальных ферментов возможен при распаде органелл.

На характер выхода ферментов из поврежденного органа влияет масса пораженного органа. Например, поражение печени обычно приводит к увеличению уровня ферментов в сыворотке крови, тогда как при заболеваниях легких они не обнаруживаются, так как масса их несколько граммов

Природа повреждения – инфекционная, химическая, механическая и другие тоже влияет на характер выхода ферментов. При обратимых воспалительных процессах, при которых происходит увеличение проницаемости мембран, высвобождаются ферменты цитоплазмы и не освобождаются митохондриальные ферменты, а при некротических состояниях разрушение клетки приводит к появлению в сыворотке крови митохондриальных ферментов (глутаматдегидрогеназы, аспартаттрансамилазы и других).

Методы количественной оценки ферментативных реакций сводятся к созданию оптимальных условий для проведения реакции и регистрации изменения концентрации субстрата, продукта или кофермента в реакционной среде. Широко применяются спектрофотометрические, флюориметрические, манометрические, поляриметрические, электродные, цито- и гистохимические методы исследования.