Полиакриламидном геле (ПААГ)
Принцип метода: коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока: в щелочной среде – к аноду, в кислой – к катоду. В щелочной среде в электрическом поле наиболее быстро перемещаются альбумины, затем α1-глобулины, α2-глобулины и γ-глобулины.
ПААГ как поддерживающая среда для электрофореза обладает рядом необходимых качеств: хорошими механическими свойствами, отсутствием сорбции биомолекул, прозрачностью для видимой части света и ультафиолета, низкими эндоосмическими показателями, возможностью получения геля с заданными размерами микропор.
Структура геля имеющая поры соизмеримые с величиной макромолекул обуславливает возможность фракционирования в электрическом поле не только по заряду, но и по молекулярной массе за счет «ситового эффекта».
Трехмерная структура ПААГ образуется в результате сополимеризации акриламида с метиленбисакриламидом в присутствии катализатора персульфата аммония и тетраметилэтилендиамида (ТЭМЭД).
Характеристика ПААГ должна соответствовать диапазону молекулярных масс разделяемых смесей. В ряде случаев эффективно применяются гели с градиентом концентрации и, соответственно, размеров пор, что позволяет значительно расширить диапазон фракционирования и увеличить разрешающую силу метода за счет нарастания «ситового эффекта» и формирования более узких зон.
Под действием электрического поля смесь белков сначала концентрируется в очень узкую зону, а затем происходит разделение ее за счет действия «ситового эффекта». Имеется много неоднородных буферных систем, позволяющих исследовать разнообразные кислые и щелочные белки при различных значениях рН и параметрах гелей, а также в присутствии детергентов. Особенно часто в электрофорезе белков применяется додецилсульфат натрия (ДСН). Являясь сильным анионным детергентом он взаимодействует со всеми белками. Комплексируясь с молекулой белка, ДСН нивелирует ее собственный заряд, превращая ее в полианион. Так как большинство белков связывает примерно одинаковое количество ДСН на единицу массы, то подвижность этих комплексов в ПААГ зависит практически только от молекулярной массы белка.
Реактивы:
1. Элекродный буфер 10* 1, 92 М глицин-трис , 1% SDS-Nа, рН 8,5. Для приготовления 1 л буфера берется 144 г глицина, 25 г триса, 10 г SDS – Nа
2. Буфер для разделяющего геля 4 * 1,5 М трис – НСI, рН 8,8; 18,05 на 100 мл Н2О
3. Буфер для концентрирующего геля 4* О,5 М трис – НСI, рН 6,8 ; 6,05 на 100 мл Н2О
4. 40% акриламид / метиленбисакриламид ( Аа /МБА) на 100 г раствора 38,1 г акриламида и 1,9 г метиленбисакриламида
5. 10 % SDS- Nа
6. 10 % персульфат аммония (ПСА) – инициирующий раствор.
7. Тетраметил этилендиамин (ТЕМЕД ) – катализатиор
Разделяющий гель:
1. 40 % Аа/ МГА – 3 мл
2. Буфер 4* - 2,5 мл ( 1,5 М трис – НСI, рН 8,8 )
3. Н2О - 4,3 мл
4. 10 % SDS – 0,1 мл
5. ТЕМЕД – 0,2 мл
6. 10 % ПСА -0,8 мл
Концентрирующий гель 5%
1.Аа/ МБА - 0,63 мл
2. Буфер 4* ( 1,5 мл трис – НСI, рН 8,8) 6,05 мл и 1,25 мл ( 0,5 М трис-НС1, рН 6,8)
3. Н2О – 3,02мл .
4.10% SDS –0,5 мл.
5. ТЕМЕД – 0,1 мл .
6.10% ПСА –0,4мл.
Разделяющий гель. Смешать: 40% Аа/ МГА, Н2О, буфер, 10% SDS Na? ТЕМЕД, 10% ПСА - добавляется непосредственно перед заливкой. Смесь перемешивают, заливают на высоту 6,5 – 7, см. Затем на гель наслаивают 0,5 мл Н2О для предотвращения доступа воздуха. Через 15 минут воду сливают, остатки удаляют фильтровальной бумагой.
Готовят концентрирующий гель в том же порядке и заливают его поверх разделяющего геля доверху и вставляют гребенку. Полимеризация геля длится не менее 1 часа с момента заливки концентрирующего геля. Образцы белка растворяются в 10 – 15 мл буфера для образцов (1 мл электродного буфера 10*, 1,0 мл 10% SDS, 0,8 мл Н2О).
Образец кипятится на водяной бане 1-2 мин, в него добавляется мочевина для утяжеления и БФС в качестве лидирующего красителя. Для фореза берется по 6 – 8 мкг на каждый белок или 30-40 мкг общего белка. Перед форезом из геля вынимается гребенка, снизу убирается скотч, сбоков остается, пластины устанавливаются в аппарат.
Электродный буфер 10* разбавляется в 10 раз и заливается в аппарат. В ячейки наносятся образцы и подается напряжение 50 V, после вхождения образцов в разделяющий гель, напряжение увеличивают до 150 V. Форез прекращают когда краситель находится у нижней кромки геля. После фореза пластинку геля отделяют от стеклянных пластин и погружают в фиксирующий раствор 50 % этанола, 5% уксусной кислоты на 15 минут. При этом происходит отмывка SDS облегчающая дальнейшее окрашивание. После этого гель погружают в окрашивающий раствор 3,5% хлорной кислоты, 0,04 % кумасси G 250 на несколько часов. После окрашивания гель отмывают в 5% уксусной кислоте.
Имеются и другие прописи приготовления реактивов:
Запасной раствор акриламида Т= 30, С=2,2 (акриламид 28,8 г, метиленбисакриламид – 1,2 г; Н2О до 100 мл) для приготовления гелей с концентрацией 10-20 %.
1. Запасной раствор акриламида Т=30, С= 6 для приготовления гелей с концентрацией 2-5 %.
2. Буфер для разделяющего геля: 3М трис-НСI, рН 8,8 (трис-оксиметиламинометан) – 1,6 г; Н2О до 100 мл; рН 8,8.
3. Буфер для концентрирцующего геля 0,5М трис- НСI, рН 6,8 (трис 6,0 г, Н2О – до 100 мл; рН 6,8).
4. Электродный буфер рН 8,4 (0,0125М трис: 0,364М глицин; 0,1% ДСН; рН 8,4).
5. Дисоциирующий буфер (0,05 М трис-НСI, рН 6,8; 2%-ный ДСН; 10%-ный глицерин; 0,001%-ный бромфеноловый синий).
6. Раствор красителя (0,25%-ный кумасси R-250 в смеси этанола: вода: уксусная кислота – 5 : 4 : 1).
7. Отмывочный раствор (этанол : вода: уксусная кислота – 2 : 7 : 1).
8. Консервирующий раствор для сушки геля (глицерин – 15 мл; уксусная кислота – 10 мл; этанол – 5 мл; Н2О – 80 мл).
9. Раствор для приготовления разделяющего геля до 15 % (запасной раствор акриламида Т –30, С =2,2 (№1) – 7,5 мл; буфер для разделяющего геля (№ 3) – 3,75 мл; Н2О – 2,5 мл; 10%-ный персульфат аммония – 0,038 мл; ТЕМЕД – 0,003мл; глицерин – 1,2 мл).
10. Раствор для приготовления концентрирующего 3% геля (запасной раствор акриламида Т =30, С=6 (№ 2) – 1 мл; буфер для концентрирующего геля (№ 4) – 2, 5 мл; Н2О – 6,45 мл; 10%-ный персульфат аммония – 0,05 мл; ТЕМЕД – 0,005 мл).
Все растворы, хранящиеся в холодильнике, перед употреблением нагревают до комнатной температуры.
Ход работы: Собрать пластинки вертикального электрофореза. Раствором акриламида № 10 заполнить камеру с помощью длинной тонкой иглы до уровня 20-25 мм ниже края вырезки на стекле. Сверху осторожно наслоить насыщенный водой бутанол и пластинку установить вертикально для полимеризации геля на 30-40 минут.
Перед формированием концентрирующего геля бутанол сливают, верхний край геля промывают раствором буфера для концентрирующего геля, вставляется гребень так, чтобы его зубцы были на 5-7 мм выше геля и заливают концентрирующий гель (№ 11). После полимеризации геля вынимают гребень, заполняют электродным буфером и в образовавшиеся карманы вносятся приготовленные образцы сыворотки крови человека в количестве 8-10 мкл. Сыворотку крови предварительно смешивают в соотношении 1:1 с диссоциирующим буфером, в который добавлен детергент и капля бромфенолового синего и смесь прогрета на водяной бане 2- 3 минуты.
Нижний электрод прибора соединяется с «+», а верхний с «–» источника постоянного тока. Электрофорез проводят при комнатной температуре при токе 18-25 мА, до того как маркерный краситель подойдет к нижнему краю геля.
Пластинка вынимается из прибора, гель помещают в кювету, ополаскивают водой и заливают красящим раствором на 30 минут при комнатной температуре. Затем гель многократно промывают отмывочной смесью до исчезновения фона. Отмытый гель помещают в консервирующий раствор на 30 минут.