Аквапорины: строение, систематика и особенности регуляции.

Впервые аквапорины были обнаружены в мембране эритроцитов млекопитающих (Agre et al., 1993). Было показано, что транспорт воды ингибируется ртутьорганическими соединениями или HgCl₂, что указывало на участие в этом процессе белка. Позже соответствующий полипептид был выделен и назван CHIP28 (channel-like integral protein of 28kDa - «каналоподобный» интегральный белок с мол. м. 28кД). После того, как был введен термин «аквапорины» (Aqp, aquaporins), CHIP28 стал называться Aqp1. иногда встречается другое название аквапоринов – «семейство MIP».

В настоящее время число известных аквапоринов превышает двести. Значительную часть семейства составляют представители растений. Только в геноме Arabidopsis thaliana обнаружено 35 генов аквапоринов, а у Zea mays – более 30.

Важную роль в исследовании водных переносчиков сыграло использование ооцитов лягушки Xenopus. Мембраны этих клеток отличаются очень низкой собственной проницаемостью для воды. если инъецировать в ооцит i-РНК, то она экспрессируется в функционально активный белок. После такой инъекции м-РНК гена aqp1 водная проводимость мембраны ооцита многократно увеличивалась.

Изучение свойств аквапоринов позволило сделать ряд важных заключений.

1. Многие аквапорины существенно снижают энергию активации трансмембранного переноса воды. То есть облегчают пассивный перенос молекул воды через мембраны. Скорость прохождения молекулы воды через канал приближается к скорости ее диффузии в объеме воды.

2. Аквапорины пропускают воду двунаправлено, а направление транспорта определяется физическими условиями среды.

3. Транспорт воды пассивен, то есть он не сопровождается энергетическими затратами и направлен по градиенту водного потенциала.

4. Аквапоринам свойственна высокая селективность. Обычно транспорт воды не сопровождается переносом каких-либо ионов, в том числе протонов, через клеточную мембрану.

5. Аквапорины чувствительны к действию ртуть-содержащих ингибиторов. Атомы ртути связываются с консервативными остатками цистеина и, по-видимому, стерически блокируют прохождение воды через канал. Существуют также свидетельства конформационных изменений в аквапоринах под действием ртути.

Некоторые Аквапорины оказались специфичными не только и не столько для воды, сколько для глицерина, мочевины, этанола, метанола, Н₂О₂, СО₂ , О₂, NH₃, NO, Na⁺. Однако эта функция аквапоринов требует дальнейшего изучения. Скорее всего, в формировании водной и катионной пор участвуют разные области белка-аквапорина.

Строение аквапоринов. Встает вопрос, за счет чего достигается столь высокая скорость и селективность транспорта воды? Ответ на этот вопрос связан с пониманием строения аквапоринов.

Аквапорины – небольшие, очень гидрофобные трансмембранные белки. Их отличительная особенность заключается в наличии внутренней гомологии между двумя половинами молекулы (рис. 5).

 

Рис. 5.Схема третичной структуры молекулы аквапорина.

Трансмембранные α – спиральные домены пронумерованы. На двух соединительных петлях отмечены короткие α – спиральные домены. Области канала обозначены стрелками.

Шесть трансмембранных α-спиральных доменов белка формируют в плоскости мембраны «бочонок». N- и С-концы направлены в цитоплазму, и с их помощью осуществляется специфическая регуляция активности аквапорина. На одной из цитоплазматических и на одной из внешних соединительных цепей образуется два коротких α-спиральных домена, которые с противоположных сторон вставлены в «бочонок» навстречу друг другу. Эти домены участвуют в формировании водного канала. Их вершины тесно сближены внутри молекулы. На каждой из вершин содержится мотив NРА(Асн-Про-Ала), консервативный для всех аквапоринов, за редким исключением. Такая структура получила название «модели песочных часов» (hourglass model).

Аквапорины образуют в мембране гомотетрамеры (рис. 6).

 

 

Рис.6. Схема четвертичной структуры тетрамера Aqp₁

Водные каналы внутри мономеров обозначены черными кольцами, а предположительный участок ионного канала – крестом.

 

Каждая из четырех субъединиц в составе комплекса образует независимый водный канал, а катионная пара, обеспечивающая ионный транспорт, лежит вдоль оси тетрамера. Устойчивость четвертичной структуры отличается в разных филогенетических кластерах аквапоринов: тетрамеры аквапоринов с глицериновой специфичностью менее прочны.

Наиболее полные сведения о строении водного канала были получены после кристаллизации Aqp1 и его последующего рентгеноструктурного анализа (рис. 7).

 

 

Рис. 7. Схема водного канала аквапорина Aqp₁ «в разрезе»

Внутренняя поверхность канала отмечена пунктиром. Карбонильные атомы кислорода (О) выстроены в цепь гидрофильных полей вдоль водной поры. В центре поры сближены остатки аспаргина (Асп) двух мотивов NPA. Обозначен атом серы (S), служащий мишенью для ртутных ингибиторов.

Канал аквапорина напоминает по форме гантель (или песочные часы). Он состоит из внешней и цитоплазматической воронок и соединяющей их узкой и длинной селективной поры. Поверхность воронок образована в основном полярными аминокислотными остатками. На ней происходит первичный отбор гидрофильных субстратов и их освобождение от гидратной оболочки за счет образования водородных связей с атомами белка. В области перехода внешней воронки в пору просвет канала резко сужен. Это стерический фильтр, не проницаемый для крупных незаряженных молекул и ионов, неспособных полностью освободиться своей гидратной оболочки. Диаметр сужения позволяет пройти через него только одиночным молекулам воды.

Чтобы прохождение воды по поре было термодинамически выгодным, в ходе него должны создаваться новые водородные связи между молекулой воды и атомами аквапорина. Со стороны белка связывание обеспечивают атомыкислорода пептидных групп нескольких последовательных аминокислотных остатков. Эти атомы расположены в две цепи вдоль внутренней поверхности поры, в остальном гидрофобной. Цепи начинаются одна от внешней, другая – от цитоплазматической воронки и идут навстречу друг другу к середине поры. Они образованы аминокислотами двух петель, содержащих короткие α-спиральные домены. Расстояние между гидрофильными полями имеет важное термодинамическое значение: более частое их расположение привело бы к росту числа промежуточных стадий транспорта, а более редкое – к увеличению энергии перехода от одной стадии к другой. В обоих случаях происходит снижение скорости транспорта воды.

Серединную область поры, расположенную в самом центре белка, формируют сближенные остатки аспарагина двух NРА-мотивов. Их амидные группы также образуют гидрофильные поля на поверхности канала. На участке перехода от одного аспарагинового остатка к другому молекула воды«вырывается» из непрерывной цепи водородных связей, которую она образовала вместе с другими молекулами воды, следующими за ней вдоль поры. Этому способствует изгиб поры и геометрия расположения гидрофильных полей. Разрыв единой трансмембранной системы водородных связей имеет большое значение для селективности канала, так как цепь из связанных между собой молекул воды может служить каналом для миграции протона. Такая миграция приводила бы к снижению в клетке трансмембранного электрохимического протонного градиента и нарушению окислительного фосфорилирования.

return false">ссылка скрыта

Многообразие аквапоринов. Семейство аквапоринов очень консервативно в эволюции. Гомологичные аквапорины обнаружены в организмах, филогенетически весьма удаленных друг от друга, что свидетельствует о глубокой древности семейства. К настоящему времени определены последовательности более двухсот генов аквапоринов как эукариотических, так и бактериальных. Недавно (2003 г.) аквапорины были найдены и у архей, что окончательно подтвердило повсеместность этих белков в живой природе.

Пока не существует единого мнения о филогенетических отношениях между представителями семейства, и предполагаются разные подходы к систематике этих белков. Существует два подхода: 1) при классификации учитывается субстратная специфичность, а также клеточная или тканевая локализация аквапоринов; 2) математический анализ известных генных последовательностей аквапоринов без учета их функциональных свойств. Последнее ведет к выделению нескольких филогенетически независимых кластеров:

1) кластер акваглицеропоринов. Большинство из них проницаемо как для воды, так и для глицерина и мочевины, причем водная проницаемость, как правило, невелика. Некоторые из этих белков способны к транспорту сурьмянистой кислоты, солей сурьмы, мышьяка, которые, видимо, имитируют глицерин. К ним относят белок GlpF Escherichia coli, Agp3, Agp7, Agp9, несколько белков немогтоды и гомолог у дрожжей. В растениях акваглицеропоринов не обнаружено;

2) аквапорины многоклеточных животных. Они являются основными белками транспорта воды в тканях млекопитающих и характеризуются преимущественно водной специфичностью. К ним относятся Agp0 (MIP), Agp1, Agp2, Agp4, Agp5 и Agp6 млекопитающих и гомологи у членистоногих;

3) филогенетически обособленное место занимают гомологи Agp8млекопитающих. Возможно, они участвуют в транспорте воды и мочевины, но физиологическая роль такого транспорта остается малопонятной;

4) в отдельный кластер выделяют прокариотические аквапорины с водной специфичностью, в том числе AgpZ E.coli.

Среди растительных аквапоринов выделяют:

5) аквапорины цитоплазматической мембраны, PIP (plasma membrane intrinsic proteins). Это относительно недавно возникший кластер с наименьшей из всех аквапоринов вариабельностью представителей. Вероятно, дивергенция белков PIP связана с эволюционным прогрессом высших растений и появлением у них специализированных тканей. Белкам PIP свойственна высокая вариабельность концевых доменов и увеличенный N-конец. Эти свойства связаны со специфической регуляцией их работы. Кластер разделяют на две группы, PIP1 и PIP2, главное различие между которыми определяются N-концевым доменом: в группе PIP1 он крупнее;

6) аквапорины тонопласта TIP (tonoplast intrinsic proteins). Они играют важную роль в поддержании клеточного тургора и водного потенциала цитоплазмы. Водная проницаемость тонопласта значительно превышает водную проводимость плазматической мембраны, поэтому осмотические или гидравлические возмущения цитоплазмы, вызванные внешними воздействиями на клетку, быстро уравниваются за счет тонопласта. Дивергенция кластера TIP произошла на ранних этапах эволюции эукариот вместе с образованием различных внутриклеточных компартментов. Эти аквапорины могут служить маркерами разных типов вакуолей. Большинство представителей кластера принадлежит к одной из трех крупных групп α TIP, γTIP и δTIP.

Кластеры PIP и TIP и водоспецифических аквапоринов животных эволюционно близки между собой;

7) малые основные мембранные белки растений, SIP (small basic intrinsic proteins). Свойства этих аквапоринов на сегодняшний день мало изучены;

8) белки Nod растений (нодулины, Nim-семейство). Они, как и акваглицеропорины, проницаемы для глицерина. Оба этих кластера характеризуются максимальной для аквапоринов скоростью эволюции, что связано со снятием структурных ограничений, требующихся для водной специфичности. Математический анализ обнаружил родство нодулинов с бактериальными водо-специфическими аквапоринами. Согласно современным представлениям, эти белки были занесены в растения из прокариот путем горизонтального генного переноса. Поводом для этого могло быть отсутствие в растениях собственных переносчиков глицерина. Белок Nod26 участвует в обмене метаболитами между цитоплазмой клеток растения и симбиотическими бактериями в клубеньках сои. Поскольку Arabidopsis и некоторые другие растения, содержащие белки этого кластера, лишены азотфиксирующих симбионтов, очевидно, что функция нодулинов не ограничивается пребыванием в составе симбиосом;

9) белок AqpM архей. Он занимает отдельное место в эволюции аквапоринов. Он обнаруживает определенное сходство как с прокариотическими аквапоринами, так и с нодулинами растений. AqpM проницаем для воды, в меньшей степени – для глицерина и, возможно, для сои. Учитывая резкие различия в строении и свойствах мембран архей и прочих групп организмов, следует отметить, что исследование AqpM может сыграть важную роль в понимании биологии аквапоринов.

Регуляция работы аквапоринов. Регуляция работы аквапоринов позволяет кон­тролировать проницаемость определённых мембран для воды и других субстратов и пере­распределять водные потоки на клеточном или тканевом уровне. Ключевыми факторами, определяющими интенсивность трансмембранного переноса воды в растениях могут быть:

а) относительное содержание в мембранах аквапоринов;

б) удельная водная проницаемость индивидуальных изоформ;

в) вероятность нахождения водной поры в открытом или закрытом состоянии. То есть, в целом - это регуляция количества аквапоринов и их активности. Эта регуляция происходит на транскрипционном, либо на посттрансляционном этапе.

Регуляция на транскрипционном уровне. В растениях выявлен целый ряд генов, кодинирующих аквапорины. Гены аквапоринов экспрессируются конститутивно или ин­дуцируются в ответ на определенные стимулы: под действием гормонов, синего света, а также при солевом и осмотическом стрессе или засухе.

Конститутивная экспрессия. Уровень экспрессии аквапоринов значительно сни­жен у САМ - растений. Скорее всего, это свойство имеет адаптивное значение. САМ -путь фотосинтеза у толстянковых является водосберегающим механизмом в условиях экстремально засушливого климата. Эффективность использования воды САМ - расте­ниями превышает аналогичный показатель Сз- растений в 5-10 раз. В лаборатории М. С. Трофимовой (ИФР) было показано, что водная проницаемость плазмалеммы и тонопла-ста, изолированных из листьев растений Mesembryanthemum crystallinum (факультатив­ное САМ- растение), значительно снижается с возрастом растений и их переходом с Сз-типа фотосинтеза на САМ. Причиной такого снижения водной проницаемости мембран в процессе стресс - индуцируемого или онтогенетически-регулируемого формирования САМ явилось снижение уровня аквапоринов. Это было показано на трёх изоформах ак­вапоринов- MIP A, MIP В и MIP С, гомологичных аквапоринам плазмалеммы (рис.4).

 

 

 

Рис. Иммунологическая идентификация MIP A., MIP B, MIP C в препаратах

клеточных мембран из С3- и САМ-растений M. Crystallinum (Божко и др., 2004). Мембраны корней (1-4) и листьев (5-8). Нечетные дорожки – плазмалемма, четные – внутриклеточные мембраны.

 

При переходе с Сз-пути на САМ-путь в листьях хрустальной травки резко снижалось содержание изученных изоформ, а в корнях не изменялось. Это означает, что дневное подавление транспирации при формировании САМ сопровождается снижением интен­сивности трансмембранного транспорта воды. Напротив, у С5 - растений (арабидопсис), в условиях подавленной транспирации активность трансмембранного переноса воды возрастала. Высказывается предположение о существовании корреляции между развити­ем суккулентности и снижением интенсивности трансмембранных водных водных потоков, проявляющейся в низком содержании в клеточных мембранах аквапоринов.

К растительным гормонам, влияющим на экспрессию аквапоринов, относятся ГК, АБК и, выозможно брассиностероиды. Ген yTIP индуцируется ГК, а ген PIP - 1 в - под действием синего света, ГК и АБК. Причём, регуляция экспрессии предусматривает чёткий баланс концентрации двух указанных гормонов. Транскрипционная регуляция экспрессии аквапоринов, возможно, связанная с накоплением АБК, наблюдается в неко­торых растениях на фоне водного дефицита. Экспрессия аквапорина Sun TIP7 в замы­кающих клетках устьиц подсолнечника обнаруживает циркадную периодичность (в те­чение суток). Активация гена происходит к полудню и белок участвует в выходе воды из замыкающих клеток при закрывании устьиц. Экспрессия Sun TIP7 наблюдается также при засухе.

К посттрансляционным событиям, влияющим на активность аквапоринов, отно­сятся фосфорилирование, гликозирование, связывание различных лигандов и протеоли-тическое расщепление. Ярким примером посттрансляционной регуляции является экспорт везикул, содержащих аквапорин Aqp2, на поверхность эпителиальных клеток в почках млекопитающих под действием гормона вазопрессина. Рецепция этого гормона приводит к активации протеинкиназы А и фосфорилированию С-концевой области Aqp2. После этого цитоплазматический домен аквапорина связывается с белками везикулярной обо­лочки, и Aqp2 в составе везикулы выводится на плазматическую мембрану. Этот механизм позволяет за очень короткий срок многократно повысить водную проницаемость мембраны.

Важное влияние на активность аквапоринов могут оказывать белок-белковые взаимодействия. Например, с компонентами цитоскелета. Аквапорины способны связы­вать ионы Са² и циклические нуклеотиды.

Фосфорилирование наблюдается е концевых доменах многих аквапоринов и час­то приводит к увеличению их активности. Таким образом, в условиях водного дефицита пул аквапоринов фосфорилирован в меньшей степени, и водная проницаемость мембран снижена, что может иметь значение при адаптации растения к засухе.

Фосфорилирование аквапоринов in vivo показано для нескольких аквапоринов выс­ших растений, в том числе для Nod 26 сои, <х-ТIР фасоли и РМ28А шпината. Оно проис­ходит по остаткам серина. Консервативные последовательности, содержащие серии или треонтин, и, вероятно, являющиеся сайтами фосфорилирования обнаружены во многих аквапоринах. В некоторых случаях фосфорилирование зависит от ионов кальция, и, воз­можно происходит при участии Са ^ч-зависимых протеинокиназ СДРК.

В опытах Т.В. Веселовой и В.А. Веселовского (МГУ) с применением NaF - ингибитора фосфатазы (гидролаза сложноэфирных связей фосфорной кислоты), которая препятствует фосфорилированию аквапоринов и, как следствие, «закрывает» водные о каналы, было показано, что у зрелых воздушно - сухих семян гороха водные каналы открыты, а на ранних этапах набухания они закрываются, ограничивая, таким образом, скорость поступления воды в клетки и предотвращая развитие гипоксии. NaF ускорял в них набухание, так как NaF препятствует закрыванию водных каналов, а ПХМБ ((n-) хлоромеркуриобензоатблокиратор аквапоринов)- не влиял на набухание. У ослаб­ленных (старых) семян происходит быстрое набухание при высокой скорости поступле­ния воды. Это не было связано с липидным бислоем (он в это время не был нарушен). NaF - не влиял на их набухание, так как каналы были открыты. В результате наблюдалась гипоксия и снижалась всхожесть.

 

 

Таблица 1. Влияние ПХМБ на набухание состаренных семян гороха и всхожесть на пятые сутки проращивания

Показатели	Концентрация ПХМБ, мкМ
	0,1	1,0	5,0	10,0	50,0	100,0
Увеличение веса семян после 20 ч набухания, % от исходного	71± 6	60 ± 6	56 ± 6	50 ± 4	48 ± 5	52 ± 6	50 ± 5
Всхожесть (число нормальных проростков), %	47 ± 3	55 ± 4	63 ± 4	67 ± 4	52 ± 5	35 ± 5	31 ± 4

 

Примечание. Партия семян с 50%-ной всхожестью без разделения на фракции. Набухание - сначала в чашках Петри (микро­пиле внерх), а затем и рулонах фильтровальной бумаги.

Таблица №2. влияние на набухание NaF на набухание состаренных семян гороха фракции I и всхожесть на пятые сутки проращивания

Показатели	Концентрация NaF, мкМ
Увеличение веса семян после 24 ч набухания, % от исходного	63 ± 5	75 ± 5	84 ± 6	83 ± 6
Всхожесть (число нормальных проростков), %	100 ± 2	90 ± 4	60 ± 6	40 ± 8

 

 

Активность аквапорина может быть связана и с консервативным остатком цистеина, локализованном у водной поры, и в петлях (доменах), обращенных как в цитозоль, так и в апопласт. SH-группы цистеина чувствительны к ртутьсодержащим соединениям. Цистеины в петлях могут быть настолько сближены, что в результате образуются S-S связи, которые понижают конформационную гибкость аквапорина. Это сказывается на его ак­тивности. Кроме того, S-S связи могут образовываться между молекулами аквапоринов. Образующаяся ассоциация аквапоринов также сказывается на их свойствах.

В работе Я. Н. Ампилоговой из лаборатории М.С.Трофимовой (ИФР) показано, что водная про­ницаемость плазмалеммы (по степени ингибирования AgCh) из проростков гороха свя­зана с изменением статуса SH-групп (восстановление и окисление пары цистеинов) в молекуле аквапорина), локализованных на N -конце, ориентированном в апопласт петли «С». Плазмалемма корней и стеблей резко отличалась по количеству SH-групп: в корнях оно было в 6 раз выше (поэтому водная проницаемость корней была ниже стеблей, хотя аквапоринов было больше).

 

Рис. Действие HgCl2 и AgNO3 на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы стеблей (1) и корней (2) проростков гороха (Ампилогова и др., 2006).

Таким образом, SH-группы цистеина снижают активность ак­вапоринов. Важное влияние на активность аквапоринов могут оказывать белок-белковые взаимодействия. Например, с компонентами цитоскелета. Аквапорины способны связы­вать ионы Са² и циклические нуклеотиды.

В настоящее время изучение аквапоринов и их вклада в физиологию клетки и орга­низма находится в фазе бурного развития.