ЗМІСТКОВИЙ МОДУЛЬ 6

ЗАНЯТТЯ 4 (2години)

Тема: Регуляція ферментативних процесів. Інгібітори та активатори ферментів. Медична ензимологія. Кількісне визначення активності α-амілази та лактатдегідрогенази у сироватці крові.

Актуальність. Досягнення ензимології (науки про ферменти) широко впроваджуються в медицину. Розвиток медичної ензимології відбувається у трьох головних напрямках (ензимопатологія, ензимодіагностика та ензимотерапія), що дозволяє вирішувати проблеми патогенезу ензимопатій, застосовувати ферментні тести для діагностики органічних і функціональних розладів органів та тканин, а також використовувати ферменти і модулятори їхньої дії як лікарські засоби. Так, підвищення активності лужної фосфатази у сироватці крові спостерігається при рахиті, пухлинах кісткової тканини, гіперпаратиреозі, механічній жовтяниці, вірусному гепатиті, а зниження – при гіпотиреозі, гіповітамінозі С та ін. Активність лактатдегідрогенази збільшується у хворих із пошкодженням міокарда, скелетних м’язів, нирок, а також при анеміях, пухлинах, гострому гепа­титі. Ферменти – пепсин, трипсин, гіалуронідаза та інші – використо­ву­ються як лікувальні препарати, а також у клініко-біохімічних лабора­то­ріях як аналітичні реактиви (глюкозооксидаза, уреаза та ін.).

Мета. Вивчити та вміти аналізувати механізми регуляції ферментативних процесів як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях; зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при вроджених (спадкових) та набутих вадах метаболізму – ензимопатіях; зміни активності індикаторних ферментів плазми крові при патологіях певних органів та тканин; застосування ферментів та їх модуляторів як фармакологічних препаратів при певних патологічних станах. Ознайомитися з методами кількісного визначення активностей α-амілази і лактатдегідрогенази у сироватці крові та їх клініко-діагностичним значенням.

 

ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ

ПІД ЧАС ПІДГОТОВКИ ДО ЗАНЯТТЯ

ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ

1. Регуляція ферментативних процесів, її шляхи та механізми: алостеричні взаємодії у ферментах, ковалентна модифікація ферментів, дія регуляторних білків-ефекторів (кальмодуліну, протеїназ, протеїназних інгібіторів). Циклічні нуклеотиди як регулятори ферментативних реакцій та біологічних функцій клітини.

2. Інгібітори та активатори ферментів. Типи інгібування ферментів: оборотне (конкурентне, неконкурентне, безконкурентне) і необоротне. Приклади.

3. Основні аспекти сучасної ензимодіагностики. Індикаторні, секре­торні та екскреторні ферменти. Ізоферменти в ензимодіагностиці, тканинна специфічність розподілу ізоферментів. Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні показники розвитку патологічних про­цесів в органах і тканинах.

4. Порушення перебігу ферментативних процесів: природжені (спад­кові) та набуті ензимопатії, природжені вади метаболізму, їх клініко-лабораторна діагностика.

5. Ензимотерапія – використання ферментів як лікарських засобів. Фармакологічне застосування ферментів шлунково-кишкового тракту, згортальної та фібринолітичної систем крові, калікреїн-кінінової та ренін-ангіотензинової систем. Інгібітори ферментів як лікарські засоби.

 

ТЕСТОВІ ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ

1. Назвіть активатор амілази слини.

А. Хлорід натрію. С. Сульфат міді. Е. Глюконат кальцію.
В. Сульфат амонію. D. Хлорид магнію.

2. Укажіть тип інгібування, при якому інгібітором ферменту є продукт реакції.

А. Конкурентне. С. Безконкурентне. Е. Ретроінгібування.
В. Неконкурентне. D. Стереохімічне.

3. Позначте фермент, активність якого слід визначати в сечі пацієнта при гострому панкреатиті.

А. Амілаза. D. Лейцинамінопептидаза.
В. Протеїнкіназа. Е. Лужна фосфатаза.
С. Холінестераза.

4. Укажіть патологію, при якій значення активності амілази крові зростає в 10 і більше разів.

А. Вірусний гепатит. D. Інфаркт міокарда.
В. Гострий панкреатит. Е. Цукровий діабет.
С. Хронічний холецистит.  

5. Назвіть фермент, активність якого визначають у плазмі крові пацієнтів із патологією кісткової тканини.

А. Пепсин. С. Амілаза. Е. Лужна фосфатаза.
В. Трипсин. D. Кисла фосфатаза.

6. Для оцінки ступеню поразки паренхіми печінки у пацієнтів визначають:

А. Концентрацію ізоформ ЛДГ1 і ЛДГ2 плазми крові.

В. Концентрацію ізоформ ЛДГ4 і ЛДГ5 плазми крові.

С. Активність амілази сечі.

D. Активність кислої фосфатази.

Е. Концентрацію ізоформи ЛДГ3 плазми крові.

7. Укажіть ізоформи ЛДГ, концентрація яких збільшується у плазмі крові пацієнтів з інфарктом міокарда.

А. ЛДГ1 і ЛДГ2. С. Тільки ЛДГ3. Е. Тільки ЛДГ5.
В. ЛДГ3 і ЛДГ4. D. ЛДГ4 і ЛДГ5.

8. Назвіть фермент плазми крові, який використовують у терапевтичній практиці для зниження кров’яного тиску.

А. Ізоформа ЛДГ1. С. Хімотрипсин. Е. Калікреїн.
В. Трипсин. D. Холінестераза.

9. Який механізм інгібування синтезу фолієвої кислоти сульфаніламідними препаратами?

А. Конкурентний. D. Неконкурентний.
В. Необоротний. Е. Зв’язування з алостеричними центрами ферментів.
С. Денатурація ферменту.

ПРАКТИЧНА РОБОТА

Кількісне визначення активності α-амілази у сироватці крові

за методом Каравея

Завдання. Визначити активність α-амілази у сироватці крові за методом Каравея.

Принцип методу. α-Амілаза (α-1,4-глюкан-4-глюканогідролаза; КФ 3.2.1.1) каталізує гідролітичне розщеплення крохмалю з утворенням кінцевих продуктів, які не дають забарвлення з йодом. Про активність фер­менту судять за надлишком крохмалю, який визначають спектрофотометричним методом за зміною забарвлення йодо-крохмального розчину.

Хід роботи. Визначення активності α-амілази у сироватці крові провести за наступною схемою.

Хімічний посуд Об’єм піпетки, мл Реактиви Проба, мл Контроль, мл Етапи
Хімічні пробірки субстратно-буферний розчин перед-інкубація
Інкубувати 5 хв при температурі 37 °С
0,1 сироватка крові 0,02 -  
змішати, інкубувати протягом 7,5 хв при температурі 37 °С (ферментативна реакція)
робочий розчин йоду кольорова реакція
0,1 сироватка крові - 0,02
  дистильована вода до 10 до 10
змішати, виміряти Епр і Ек при довжині хвилі 630–690 нм у кюветі (10 мм) проти дистильованої води протягом 5 хв (фотометрія)

 

Активність α-амілази у сироватці крові розрахувати за наступною формулою:

активність α-амілази г/л∙год = × 160×К,

де Ек – екстинкція контролю, Епр – екстинкція проби, 160 – коефіцієнт розрахунку, який враховує кількість крохмалю, введеного в пробу і контроль, на 1 л біологічної рідини за 1 год інкубації при температурі 37 °С; К – коефіцієнт розбавлення досліджуваної сироватки крові.

return false">ссылка скрыта

Клініко-діагностичне значення. У нормі активність α-амілази в сироватці крові становить 12–32 г/(год×л). При захворюваннях підшлункової залози спостерігають її підвищення у крові та сечі. При гострому панкреатиті активність α-амілази підвищується в 10–30 разів, стає максимальною на першу добу хвороби, а на другу-шосту - швидко нормалізується. Гіперамілаземія також трапляється при гострому апендициті, перфоративній виразці шлунка та дванадцятипалої кишки, холециститі, розриві жовчного міхура, опіках, травматичному шоку, пневмонії, простатиті, уремії. Підвищенню активності α-амілази сприяють лікарські препарати (кортикостероїди, катехоламіни, фуросемід, антикоагулянти), наркотики, алкоголь. Зниження її активності спостерігають при гепатиті, цирозі, злоякісних утвореннях печінки, цукровому діабеті, гіпотиреозі, кахексії.

 

Кількісне визначення активності лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27)

у сироватці крові за Севелом і Товареком

 

Завдання. Визначити активність лактатдегідрогенази (ЛДГ) у сироватці крові за Савелом і Товареком.

Принцип методу. Під впливом ЛДГ L-лактат за наявності нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАД) окислюється до пірувату. Кількість утвореного пірувату визначають фотометрично за кольоровою реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином, в якій утворюється 2,4-динітрофенілгідразон, що має червоно-буре забарвлення в лужному середовищі, його інтенсивність прямо пропорційна вмісту кетокислоти.

ЛДГ

СН3-СН(ОН)-СООН + НАД+ → СН3-СО-СООН + НАДН(Н+)

лактат піруват

Хід роботи. В одну пробірку вносять 0,1 мл розведеної у 3 рази сироватки крові, 0,3 мл свіжовиготовленого розчину 0,02 моль/л НАД+ і ставлять на 5 хв на водяну баню при 37 °С для нагрівання суміші. У другу пробірку вносять 0,8 мл розчину 0,03 моль/л натрію пірофосфату, 0,2 мл розчину 0,45 моль/л натрію лактату і нагрівають на водяній бані при 37 °С. Виливають вміст другої пробірки в першу, швидко перемішують скляною па­личкою, не виймаючи пробірки з бані, й відзначають час початку інкубації. Через 25 хв реакцію припиняють додаванням 0,5 мл 0,2% розчину 2,4-ди­ніт­ро­фенілгідразину в розчині 1 моль/л хлоридної кислоти і залишають пробірку на 20 хв при кімнатній температурі для утворення гідразону. До суміші додають 5 мл розчину 0,4 моль/л натрію гідроксиду, перемішують скляною паличкою і через 10 хв вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної на ФЕК при довжині хвилі 520-560 нм у 10 мм кюветах. Контрольну пробу готують так само як і дослідну, але розведену сироватку додають після інкубації. Активність ферменту розраховують за калібрувальним графіком, умови побудови якого наведені в таблиці.

№ пробірки Робочий стандартний розчин натрію пірувату, мл Розчин 0,03 моль/л натрію пірофос-фату, мл Дист. вода, мл Вміст пірувату в пробі, мкмоль Одиниці активності ЛДГ ммоль/л×год Екс-тинкція
0,1 0,8 0,5 0,01 1,2  
0,2 0,8 0,4 0,02 2,4  
0,4 0,8 0,2 0,04 4,8  
0,6 0,8 - 0,06 7,2  
0,8 0,8 - 0,08 9,6  

На осі ординат відкладають значення екстинкції, а на осі абсцис – відповідні їм одиниці активності ЛДГ, виражені в ммоль/л∙год.

Клініко-діагностичне значення. Визначення активності ЛДГ використовують у клініко-біохімічних лабораторіях для діагностики захворювань, а також як тест на одужання. У нормі активність ферменту в сироватці крові становить 0,8–4,0 ммоль/л×год. Вона підвищується при ушкодженні міокарда, лейкозі, хворобі нирок, гемолітичній та серпоподібноклітинній анемії, тромбоцитопенії, інфекційному мононуклеозі, а також прогресуючій м’язовій дистрофії. При хворобах, які супроводжуються некрозом тканин (інфаркт міокарда, некротичні ураження нирок, гепатит, панкреатит, пухлини) спостерігають різкофії. При хворобах, які супроводжуються некрозом тканин (інфаркт міокарда, некротичні ураження нирок, гепатит, панкреатит, пухлини) спостерігають різке підвищення активності ЛДГ у сироватці крові. При гострому гепатиті вона підвищується в перший тиждень жовтяничного періоду, при легких та середньої важкості формах хвороби швидко нормалізується. У хворих із гострим інфарктом міокарда спостерігається підвищення загальної ЛДГ та ЛДГ1 у сироватці крові через 8–18 год після початку нападу, яке досягає максимуму через 24–72 год. Активність фер­ментів залишається високою протягом першого тижня і нормалізується на 6–10-й день. Також має значення визначення співвідношення ЛДГ1/ЛДГ2, яке у нормі складає 0,4–0,74, а при гострому інфаркті міокарда зростає у 5–10 разів. При стенокардії активність ЛДГ у сироватці крові не підвищується.