Ж. Молекулярно – генетический метод

Молекулярно – генетический метод определяет вариации в структуре исследуемого участка ДНК (аллель, ген, регион хромосома).

Методика:

I. Получение образцов ДНК/РНК.

1 вариант – выделение из ядросодержащих клеток (лейкоциты, амниотические клетки, хориональные клетки, фибробласт) геномной ДНК

2 вариант – Накопление определённых фрагментов с помощью ПЦР: фрагменты необходимо амплифицировать (выделить ДНК) in vitro. Зная нуклеотидную последовательность амплифицированного фрагмента, можно синтезировать 2 олигонуклеотидных праймера. Цикл:

1стадия – температурная денатурация ДНК (из двухцепочечной становится одноцепочечной)

2стадия – отжиг – т.е. соединение праймеров и комплементной одноцепочечной ДНК

3стадия – синтез полипептида за счёт фермента полимеразы

II. Рестрикция двухцепочечной ДНК на фрагменты за счёт фермент рестриктаз

III. Электрофорез фрагментов ДНК: разделение и распределение фрагментов на агаре, полиакриле

IV. Визуализация, идентификация фрагментов ДНК

 

Генетик должен определить специфические фрагменты – БЛОТ-гибридизация по Саузерну:

ü Денатурация ДНК с помощью щёлочи

ü Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр в буферном растворе

ü Специфические по нуклеотидной последовательности меченые радионуклеотиды или флюорометрическая метка олигонуклетидным синтетическим зондом или клонированным фрагментом ДНК

 

Таблица. Различные молекулярно-генетические методики и спектр выявляемой патологии

Методика	Заболевания
Определение нуклеотидной последовательности генов (секвенирование)	Гемофилия Тромбофилия Гемоглобинопатии Митохондриальные болезни
Прямая детекция мутантных генов	Муковисцедоз Умственная отсталость, сцепленная с Х-хромосмой Фенилкетонурия Миопатия Дюшенна
Генетический анализ полиморфизма ДНК родителей и ребёнка (сцепление генов)	Около 300 наследственных болезней
Определение первичного продукта гена	Миопатия Дюшенна Болезни накопления (лизосомальные, пероксисомные)

 

ПРИНЦИПЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ

Медико-генетическое консультирование (МГК) является специальным видом медицинской помощи населению для прогнозирования и предупреждения возникно­вения и распространения наследственных болезней. В результате МГК больные или их родственники с наследственным или пред­положительно наследственным заболеванием получают информацию о последствиях данного заболевания, вероятности его развития и на­следования, возможных путях лечения и профилактики.

 

Функции врача-генетика:

 

1.Помощь врачам других специальностей (невролога, педиатра) в в постановке диагноза при подозрении на наследственную патологию спомощью специальных генетических методов.

2. Прогнозирование потомства:

- ретроспективное (когда в семье уже есть больной ребенок);

- проспективное (до рождения, с помощью методов пренаталь-ной диагностики).

 

Показания для проведения МГК:

1. Рождение ребёнка с множественными врождёнными пороками развития

2. Задержка психомоторного развития

3. Спонтанные аборты, мертворождение и выкидыши у матери

4. Близкородственные браки

5. Подозрение на тератогенное воздействие во время беременности

6. Неблагоприятно протекающая беременность

7. Подозрение на наследственную патологию у обследуемого при наличии родственников с наследственными заболеваниями

Этапы МГК:

I.Уточнение диагноза наследственного заболевания с генетической точки зрения, принимая во внимание гетерогенность генетических заболеваний.

Методы – генеалогический, цитогенетический, метод сцепленных генов, генетика соматичексих клеток, биохимический, иммунологический.

 

II.Опеределение прогноза потомства.

Формируется генетическая задача, которая решается в теортических расчётах с помощью методов генетического анализа вариационной статистики, либо на эмпирических данных. Испльзуют пренатальную диагностику заболевания плода.

 

III.Письменное заключение.

Письменное заключение и устное объяснение смысла генетического риска семье в доступной форме.

 

IV.Советы семье.

 

МГК включает:

 

1) Менделирующие заболевания:

а) когда известен генотип (расчёт по законам Менделя);

б) когда генотип неизвестен (расчёт по таблицам эмпирического риска);

2) Неменделирующие заболевания (расчёт по таблицам эмпирического риска

 

Медико-генетическое консультирование следует начинать с подробного клинического обследования пробанда и осмотра макси­мально большего числа его родственников, что позволит более точно определить диагноз и составить прогноз.

При оценке фенотипа пробанда и его родственников необходи­мо четко дифференцировать пороки развития и стигмы дисэмбриоге-неза.

Врожденные пороки развития - это стойкие морфологические изменения органа (органов), возникающие втгутриутробно и выходя­щие за пределы нормальных вариантов строения, сопровождающиеся нарушением функций органов требующих хирургической, ортопеди­ческой или иной коррекции.

Стигмы дисэмбриогенеза - это те же врожденные пороки разви­тия, но не вызывающие нарушений функций органов и не требующие коррекции.

 

Большинство больных с наследственными заболеваниями имеет характерный внешний вид. При описании фенотипа следует руково­дствоваться следующими морфологическими признаками:

Масса тела: нормальная, избыточная, сниженная.

Рост: нормальный, увеличен, уменьшен.

Кожа: шелушащаяся, ихтиоз, гиперкератоз, очаговая аплазия, буллезный эпидермолиз, витилиго, альбинизм, невус, телеангиоэктазия, ангиомы, липомы, фибромы, птеригиум (крыловидная складка), складчатая гиперплазия волосистой части головы, резко утолщенная изборожденная кожа (cutis gyrata), склеродермия, рубцы врожденные, жировые грьгжы.

Ногти: ломкие, расщепляющиеся на пластинки, типа "часовых стекол", очаговая аплазия, очаговая гиперплазия, анонихия, пахионихия.

Волосы: ломкие тонкие, алопеция (гнёздная или тотальная), ги­пертрихоз, гипотрихоз, альбинизм.

Подкожно-жировая клетчатка: избыток, недостаток, лимфоидный отек, склеродерма.

Мышцы: аплазия большой грудной мышцы, аплазия прямых мышц живота, аплазия других мышц, расхождение (диастаз) прямых мышц живота, гипотония, гипертония.

Череп: брахицефалия (увеличение поперечного размера при от­носительном уменьшении продольного), долихоцефалия (увеличение передне-заднего размера), скафоцефалия (длинный и узкий череп с низким выступающим лбом и затылком), акроцефалия (высокий "башенный" череп), тригоноцефалия (широкий лоб и узкий затылок), плагиоцефалия (асимметрия мозгового черепа), макроцефалия (увеличенные размеры черепа), мик­роцефалия (уменьшенные размеры черепа), выступающий лоб, скошенный лоб, низкий лоб, клино­видный рост волос книзу от средней линии ("мыс вдовы"), платице­фалия (плоский свод), выступающий затылок, клиноцефалия (череп с седловидным углублением в области темени).

Ушные раковины: микротия(уменьшенные), макротия (увеличенные), низкорасполо­женные, оттопыренные («лопоухообразные»), горизонтально вытянутые, «уши сатира» (вертикально вы­тянутые с острой вершиной), деформированные, со сглаженным рисунком, с предушными фистулами, с предушными папилломами, насечки ушных рако­вин, атрезия слухового прохода, стеноз слухового прохода.

Глаза: гипоплазия надбровных дуг, синофриз (сросшиеся бро­ви), высокие дугообразные брови, диситихиаз, необычно длинные и загнутые ресницы, колобома века (сегментарный сквозной дефект края века), колобома радужки (сквозной сегментарный дефект радужной оболочки), эпикант (эпикантус, «монгольская складка» — особая складка у внутреннего угла глаза, в большей или меньшей степени прикрывающая слёзный бугорок, является продолжением складки верхнего века; один из признаков, характерных для монголоидной расы, редкий у представителей других рас), анкилоблефарон (сращение краев век), телекант (смещение внутренних углов глаз латерально при нормаль­ном расположении орбит), косоглазие, монголоидный разрез глаз (внутренние углы глаз находятся ниже, чем наружние), антимонголоидный разрез глаз (наружние углы глаз находятся ниже, чем внутренние), гипертелоризм (увеличенное расстояние между внутренними углами глазных щелей), гипотелоризм (укороченное расстояние между глазными щелями), короткая глазная щель, птоз (опущение века), микрофталъмия (уменьшенный размер глазного яблока), анофтальмия (отсутствие глазного яблока), криптофтальмия (сращение век, роговицы, отсутствие тарзальных пластин), экзофтальм, эпитарзус (складки конъюнктивы, идущие параллельно краям век и переходя­щие на другую сторону), голубые склеры, меланоз склер, помутнение роговицы, аниридия (отсутсиве радужной оболочки), белесоватые пятна Брушвильда на радужке, микрокорнеа (уменьшенная радужка), макрокорнеа (увеличенная радужка), гетерохромия радужки (разный цвет глаз или разная окраска участков радужки одного глаза), врожденная ката­ракта (помутнение хрусталика), эктопия хрусталика (неправильно расположенный хрусталик), афакия (отсутствие хрусталика), пигментная дистрофия сетчатки, циклопия (глазные яблоки полностью или частично сращены и помещены в одной глазнице, которая расположена по средней линии лица), нистагм, стеноз носослезного канала, эпибульбарный дер­моид.

Нос: клювовидный, мясистый, плоская переносица, уплощение крыльев носа, спинка вогнутая, спинка выпуклая, спинка прямая, открытые вверх ноздри, расщелина носа, колобома крыльев носа, искривление носовой пере­городки, атрезия хоан.

Губы и полость рта: короткая или длинная верхняя губа, макростомия (увеличенная ротовая щель), микростомия (уменьшенная ротовая щель), "рыбий" рот, опущенные углы рта, расщелины верхней или нижней губы, горизонтальная или выступающая верхняя губа, тонкие или толстые губы, ямки, бороздки или втяжение на нижней губе.

Верхняя и нижняя челюсти: выступающая верхняя челюсть, не­доразвитие верхней челюсти, чрезмерное развитие нижней челюсти, недоразвитие нижней челюсти, ретрогения, аплазия нижней челюсти, расщелина нижней челюсти, сквозная расщелина верхней губы и не­ба, диастема, расширение альвеолярных отростков.

Зубы: адонтия, сверхкомплектные зубы, аномалии формы, ано­мальная локализация, замедленное прорезывание, ускоренное проре­зывание, множественный кариес.

Язык: аглоссия, микроглоссия, макроглоссия, анкилоглоссия, лобуляция языка.

Небо: плоское, высокое, "готическое", расщелины мягкого и твердого неба.

Шея: короткая, длинная, низкий рост волос, кривошея, средин­ные и боковые кисты и свищи

Грудная клетка: широкая, узкая, воронкообразная, килевидная, короткая грудина, широкое расположение сосков, полителия, ателия, гинекомастия, дополнительные ребра, недостающие ребра, аномалии лопатки, асимметрия грудной клетки, широкий угол между реберны­ми дугами, аномалии ключицы.

Позвоночник: скрытая расщелина, сакральный синус, гипертри­хоз пояснично-крестцовой области, спинномозговая грыжа, лордоз, кифоз, сколиоз.

Живот: низкое расположение пупка, гипоплазия таза.

Верхние конечности: удлинение, укорочение, гипоплазия плеча или предплечья, аплазия лучевой или локтевой кости, трехфаланго-вый большой палец, лучевая косорукость, передняя косорукость, аплазия плеча, фокомелия ("тюленеобразные" руки), полное отсутст­вие проксимальной (с плечевым суставом) и/или средней части руки при относительно сформированных кистях, перомелия, абрахия, мо-нобрахия, эктродактилия ("клешнеобразная" кисть), поперечные де­фекты рук (гемибрахия, ахейрия, адактилия, афалангия), олигодактилия, монодактилия, аплазия костей запястья, синостозы, вывих го­ловки лучевой кости, камтюдактилия (сгибательная контрактура пальца в проксимальном межфаланговом суставе, клинодактилия (искривление пальца), полидактилия, широкие, узкие или короткие кисти, брахидактилия, макродактилия, арахнодактилия, гипоплазия или расширение большого пальца, особенности сгибания пальцев (перекрывание), разгибательная контрактура в дистальных межфаланговых суставах.

Нижние конечности: удлинение, гипоплазия костей, короткая, широкая, полая или плоская стопа, удлинение или укорочение боль­шого пальца, неправильное расположение пальцев, фокомелия, попе­речные дефекты ног (аподия, эктроподия, адактилия, афалангия), анус, моноапус, олга одактилия, монодактилия, брахидактилия, поли­дактилия, эктродактилия, гиперфалангизм, синдактилия, варусный или молоткообразный большой палец, сандалевидная щель, сиреномелия, врожденный вывих бедра, варусная или вальгусная деформа­ция шейки бедра, плоско-вальгусная стопа, "конская" стопа, пяточная стопа, стопа -"качалка", врожденная косолапость, синостоз костей предплюсны или плюсны, контрактуры суставов, полимелия, кампомелия (изогнутая конечность), симфалангия или ортодактилия (сращение фаланг пальцев), хондродисплазия.

 

Предпочтительнее предсказать появление врожденного дефекта, чем устанавливать его уже после рождения ребенка. Для этого разра­ботаны методы пренатальной диагностики, позволяющие устано­вить точный диагноз тяжелой наследственной болезни у плода еще в начале беременности.

 

Показания к проведению пренатальной диагностики (женщины группы риска):

a. Возраст матери старше 35 лет.

b. Рождение ребенка с врожденными пороками развития и хромосомными аномалиями.

c. Моногенные заболевания, которые раньше были выявлены у родителей и родственников.

d. Выявление носителей семейной хромосомной аномалии.

e. Длительное бесплодие или невынашивание беременности (наличие не менее двух самопроизвольных абортов на ранних сроках в прошлом).

f. Патологическое течение беременности.

g. Облучение кого-либо из супругов.

h. Приём фармпрепаратов перед беременностью или на ранних сроках.

i. Перенесённых вирусные инфекции (гепатит, краснуха, токсоплазмоз и др.)

 

К методам пренатальной диагностики относятся:

 

Группа	Виды	Сроки
Просеивающие неинвазивные	МГК Определение α-фетопротеина в сыворотке крови N=26 нг/мл Хореонический гонадотропин N=9 т.Ед Неконьюгированный эстриол N=12 мг/с АХЭ (антихолинэстераза)	До и во время беременности 16-20 неделя 16-20 неделя 16-20 неделя 16-20 неделя
Неинвазивные	УЗИ	12, 22-24, 32-34 неделя
Инвазивные	Хорионбиопсия Плацентобиопсия Амниоцентез Биопсия кожи Кордоцентез Биопсия мышц Фетоскопия	9-14 неделя 16-20 неделя 15-18 неделя 14-16 неделя 18-24 неделя 18-22 неделя 18-22 неделя

 

Женщинам группы риска, как и другим беременным, проводят неинвазивную пренатальную диагностику, включающую в себя скрининговые биохимические тесты и УЗИ.

Если результаты скрининговых тестов настараживают врача, и при этом женщина входит в группу риска, специалист определеят необходимость проведения инвазивных процедур.

Если женщина не входит в группу риска, но результаты анализов и УЗИ оказались сомнительными, то ей также назначают проведение одного из методов инвазивной дианостики.

Решение о проведении исследования принимает семья на основании той информации, которую предоставил врач. Врач рекомендует исследование только в том случае, если риск тяжёлого заболевания у плода превышает риск развития осложнений от проведения инвазивной диагностики. При этом берутся в расчёт и «цены» рисков, различные в разных случаях. Например, 7%-риск для женщины, имеющих троих детей, и тот же риск для женщины, у которой нет детей (данная беременность является первой после 10 лет бесплодия, или предыдущие беременности закончилисьвыкидышами), будут оценён по-разному.

В отличие от неинвазивных методов, инвазивная пренатальная диагностика предполагает вторжеие в полость матки с целью получения биологического материала.

Хорионбиопсия. В I-м триместре с 9 по 12 (14) неделю возможно использование метода биопсии хо­риона, при котором определяется кариотип плода (например, синдром Дауна, Эдвардса, Патау).

Методика: в амбулаторных условиях под местной анестезией проводится прокол через переднюю брюшную стенку под контролем УЗИ. После соприкосновения с хорионом, не касаясь плода, с помощью шприца через иглу насасывается некоторое количество ткани хориона. Результат анализа известен спустя 4-7 дней. При необходимости выполняется прерывание беременности.

Риски: 1) риск ложноположительных и ложноотрицаетельных результатов, что объясняется «плацентарным мозаицизмом» - неидентичностью генома хориона и эмбриона. Точность диагностики 99%ж; 2) риск выкидыша, кровотечения у женщины, риск инфицирования плода, неблагоприятного течения беременности при резус-конфликте (хорионбиопсия может способствовать выработке антирезусных антител). В целом риск перечисленных осложнений составляет при этом методе 2-3 %.

Плацентоцентез.Во II-м триместре с 16 по 20 неделю (оптимально в 15-17 недель) возможно проведение биопсии плаценты для выявления хромосомных и генных заболеваний. Плацента – то, во что со временем превращается хоион. Методика выполнения аналогична хорионбиопсии.

Риски: отслойка плаценты, угроза прерывания беременности.

Кордоцентез.Во II-м триместре беременности с 18 по 24 неделю возможно проведение пункции сосудов пуповины (кордоцентез) для 1) диагностических целей: выявление хромосомных, генных заболеваний, анализ пуповинной крови на концентрацию гормонов, иммунологических и биохимических показателей, инфицирование и др.; 2) лечебных целей: введение лекарственных средств, внутриутробное вливание крови плоду, например, при тяжёлом резус-конфликте.

Методика: прокол передней брюшной стенки под контролем УЗИ и пункция пуповины с получнием пуповинной крови.

Риск: прерывание беременности в 3.3% случаев.

После любой процедуры инвазивной пренатальной диагностики беременная женщина в течение 3-4 часов остаётся под контролем специалистов. Для профлактики различных осложнений женщине могут назначаться специальные лекарства. Если в ходе наблюдения отмечаются те или иные осложнения – возникает угроза прерывания беременности, отслойка плаценты, то женщину госитализируют в стационар и проводят лечение осложнений.

С помощью методов пренатальной диагностики возможно вы­явление наследственных заболеваний и грубых пороков развития у плода, что позволяет на ранних сроках выполнить аборт по медицин­ским показаниям.

Полученный в ходе инвазивных методов биоматриал отправляют в лабораторию для проведения следующих видов исследований:

Метод	Объект	Показания
Цитогенетический (определяют наличие дополнительных или отсутствующих хромосом)	Клетки хориона, амниотические клетки, лимфоциты плода	1) Женщины старше 35 лет 2) Хромосомные мутации у одного из родителей 3) Предыдущий ребёнок с хромосомной патологией (синдром Дауна, Клайнфельтера, Тернера) 4) Аменорея 5) Низкий уровень α-фетопротеина в сыворотке крови женщины 6) УЗИ признаки вероятной хромосомной патологии у плода
Молекулярно-генетический (наличие дефекта внутри хромосом) Биохимический (определение степени зрелости лёгких плода, определение наличия и тяжести резус-конфликта) Иммунологический	Клетки хориона, амниотические клетки, пуповинная кровь	1) Высокий риск рождения ребёнка с наследственной патологией по результатам МГК или просеивающих программ 2) Определение гетерозиготного носительства гемофилии, фенилкетонурии, мышечной дистрофии Дюшенна, муковисцедоза 3) Диагностика внутриуторбных инфекций плода, иммунодефицта, иммуноконфликта
Патоморфологическое исследование	Кожа плода Мышцы плода	Высокий риск рождения ребёнка с наследственной патологией кожи (ихтиоз, эпидермолиз), с ервно-мышечными заболеваниями (миодистрофия Дюшенна)
Фетоскопия		Уточнение диагноза множественных внутриутробных пороков развития

 

 

Противопоказаниядля проведения инвазивных методов пренатальной диагностики:

 

v Угроза прерывания беременности (однако, подобная угроза часто возникает при наличии тех или иных пороков развития плода, и исследование необходимо, чтобы определить дальнейщую тактику ведения беременности, а для сохранения беременности исследование проводится на фоне соответствующей терапии)

v Пороки развития матки

v Высокая температура

v Активные инфекционные заболевания

v Миоматозные узлы, расположенные на пути введения иглы

v Расположение плаценты на пути введения иглы

 

 

ХРОМОСОМНЫЕ БОЛЕЗНИ

Хромосомные болезни представляют собой большую группу врождённых патоло­гических состояний, при которых клинические проявления заключаются в наличии множественных пороков развития, а генетическая суть состоит в изменении числа и/или структуры хромосом как аутосом, так и половых (геномные мутации, хромосомные аберрации).

Хромосомные заболевания являются достаточно частой причиной спонтанных абортов и мертворождений.

Правило записи нормального кариотипа: 46 XX – женщина, 46 XY – мужчина (22 пары аутосом и 1 пара половых хромосом XX/ XY). Каждая хромосома имеет короткое плечо и длинное плечо. Плечи делятся на районы, районы – на сегменты.

Хромосомные аномалии могут быть 1) полными – т.е. все клетки имеют одинаковый патологический кариотип; либо 2) частичными (мозаичными) – т.е. часть клеток организма имеют нормальный генотип, часть клеток несут патологический генотип.

Классификация

А. Хромосомные болезни, связанные с аномалиями числа хромосом при сохранении их структуры:

• болезни, обусловленные числовыми аномалиями половых X и Y хромосом (синдром Клайнфельтера 47 XXY, Синдром Шерешевского - Тернера X0, синдром двойной Y хромосомы XYY, синдром «сверхженщины» XXX);

• болезни, обусловленные числовыми аномалиями аутосом (трисомии – добавочная хромосома – синдромы Дауна, Эвардса, Патау, моносомия – отсутствие хромосомы);

• болезни, обусловленные увеличением полного гаплоидного набора хромосом (полиплоидии - 69 XXY, 69 XXX, синдром двойного набора половых хромосом XXYY);

Б. Хромосомные болезни, обусловленные разрывом хромосом и их перестройкой (хромосомные аберрации, частота 1 на 4000 новорожденных) самопроизвольного характера или в результате инфекционных, интоксикационных и каких-либо других факторов:

1) Сбалансированные – реципрокная транслокация – взаимообмен сегментов хромосом без потери, т.е. все локусы у хромосом есть, но в патологическом порядке;

2) Несбалансированные

• транслокация нереципрокная – перенос сегментов с одной хромосомы на другую хромосому с формированием изохромосом или метацентрических хромосом: p-q→ p-p по короткому плечу или q-q по длинному плечу. Например, синдром Дауна, Эдвардса, Патау;

• делеция (частичная моносомия) – отсутствие участка хромосомы с формированием кольцевой хромосомы или хромосомы концевого типа. Например, синдром «кошачьего крика» - делеция 5 хромосомы по короткому плечу p-;

• инверсии – разрыв сегментов одной хромосомы и соединение этих участков в другом порядке;

• дупликации – удвоение участков хромосом.