Описание лабораторных работ, выполняемых на занятии
Работа 1. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны
Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала (продукт гидролиза крахмала обнаруживают пробой с йодом) под действием α-амилазы слюны до и после добавления фенилтиомочевины, ионов Cl- и Cu2+.
Ход определения.Берут 4 пробирки и наливают по 10 капель: в первую – дистиллированной воды, во вторую – раствора хлорида натрия, в третью – раствора сульфата меди, в четвёртую – раствора фенилтиомочевины, а затем по 20 капель раствора крахмала и по 1 капле разведённой слюны. Содержимое перемешивают встряхиванием, помещают пробирки в водяную баню при 38°С и засекают время начала инкубации.
Через каждую 1-2 минуты из пробы отбирают в другие пробирки по 1 капле жидкости и добавляют 1 каплю раствора иода в иодиде калия. Отмечают время появления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) при проведении реакции с йодом в каждой из пробирок.
Оформление работы.Результаты занести в таблицу, сделать вывод о действии изученных веществ и предполагаемом типе ингибиторов.
| Фермент | Модификатор активности | Субстрат | Время образования эритродекстринов, мин (пробы с иодом) |
Вывод:
Работа 2. Действие конкурентных ингибиторов на сукцинатдегидрогеназу мышечной ткани
Метод основан на сравнительном определении активности сукцинатдегидрогеназы по обесцвечиванию в ходе реакции метиленовой сини (МС) как акцептора водорода в присутствии и в отсутствие малоновой кислоты
Образующийся ФАД∙Н2 восстанавливает метиленовую синь (МС∙Н2), в результате чего происходит обесцвечивание раствора. Сравнивая визуально уменьшение интенсивности уменьшение синего окрашивания с пробами, содержащими разные количества малоновой кислоты (НООС-СН2-СООН), делают вывод о типе действия её на фермент.
Ход определения.В 3 пробирки помещают по 3-4 грамма мышечной кашицы и добавляют в первую пробирку 0,8 мл воды, во вторую – 0,2 мл раствора малоновой кислоты и 0,6 л воды, а в третью – 0,8 мл раствора малоновой кислоты.
Во все пробирки приливают по 1 мл раствора сукцината натрия, по 1 капле раствора метиленового синего и после перемешивания по 3-4 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню при 37°С. Через 3-5 мин наблюдают обесцвечивание раствора.
Оформление работы. Сравнить интенсивность голубого окрашивания в трёх пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.
Результат:
Вывод:
Практическое значение работы.Конкурентные ингибиторы различных ферментов широко применяются в биохимических исследованиях и в практической медицине как лекарственные препараты. В частности, малоновая кислота как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы используется в экспериментах на животных для того, чтобы изучить изменения в обмене веществ в тканях при блокаде этого фермента, а также для исследования самого механизма конкурентного торможения.
Работа 3. Неконкурентное ингибирование каталазы крови.
Метод основан на визуальном сравнении интенсивности выделения пузырьков газа (кислорода) при разложении пероксида водорода с участием каталазы крови в отсутствие и в присутствии азида натрия NaN3.
Ход определения.В 2 пробирки вносят по капле крови и добавляют в одну из них 2 капли воды, а в другую – такой же объём раствора азида натрия. Пробы встряхивают.
Через 2 минуты прибавляют в обе пробирки по 2 мл 3%-ного раствора пероксида водорода и сравнивают интенсивность выделения пузырьков газа.
Оформление работы. По полученным данным сделать вывод о действии азида натрия на каталазу крови и указать на практическое значение работы.
Практическое значение работы.Неконкурентными ингибиторами геминовых ферментов (цитохромы, цитохромоксидаза, каталаза, пероксидаза) являются азиды и цианиды, которые взаимодействуют с железом гемма, входящего в активный центр, подавляя тем самым каталитическую активность этих ферментов. Благодаря этому азиды и цианиды являются сильными ядами. Учитывая, что они неконкурентные ингибиторы, снять их действие можно только теми веществами, которые связывают их и освобождают из активного центра фермента.