Способы размножения растений in vitro

Практическая работа № 1

КЛОНАЛЬНОЕ МИРОРАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ IN VITRO

Цель занятия. Ознакомиться с методиками стерилизации растительного материала, выделением меристематических верхушек, посадки эксплантов на питательную среду, работы в ламинар-боксе.

Ход работы

 

Приготовление питательной среды Мурасиге-Скуга

Задание: Приготовить питательную среду для введения в культуру меристематических верхушек, верхушек побегов, боковых почек.

Ход работы:Зная, сколько миллилитров маточного раствора нужно взять из каждого сосуда для приготовления 1 л среды (таблица 1), и умножив эту цифру на запланированный объем среды, отмеряют количество маточного раствора из каждого сосуда и смешивают вместе. Затем добавляют углеводы и после их растворения доводят объем до запланированного. С помощью рН-метра раствор корректируют до нужного рН. Раствор нагревают и небольшими порциями добавляют агар, после начала кипения среду разливают по сосудам.

 

Таблица № 1. Состав среды Мурасиге-Скуга

Компоненты	Концентрация солей в 1 литре готового маточного раствора, мг	Объем маточного р-ра, мл для приготовления 1 литра среды
маточный раствор макроэлементов
NH4NO3
KNO3
CaCl2 * 2H2O
MgSO4 * 7H2O
KH2PO4
маточный раствор микроэлементов
KJ
H3BO3
MnSO4 * H2O
ZnSO4 * 7H2O
Na2MoO4 * 2H2O
CuSO4 * 5H2О
CoCl2 * 6H2O
маточный раствор хелатного железа
FeSO4 * 7H2O
Na2ЭДТА * 2H2O
витамины и органические вещества
Мезоинозит
Никотиновая кислота
Пиридоксин-HCl
Тиамин-HCl
Глицин
Добавлять в виде порошка в среду перед варкой: Сахароза - 30 г/л Агар-агар - 7 г/л рН готовой среды - 5.6-5.8

 

Сосуды с питательной средой закрывают либо фольгой и автоклавируют при 0,9-1 атм. 15-18 мин. в автоклаве. Добавление нетермостойких ве­ществ в питательную среду проводят после ее стери­лизации автоклавированием и стерилизации веществ через специаль­ные фильтры в ламинар-боксе.

2. Введение эксплантатов в культуру

Задание: Простерилизовать растительный материал, находящийся в покое, и вегетирующий растительный материал. Приготовить 5-10 меристематических верхушек и посадить на соответствующую среду.

Ход работы: В практике микроклонального размножения используют следую­щие стерилизаторы: гипохлорид кальция, гипохлорид натрия, перекись водорода, бромная вода, нитрат серебра, сулема (0,1-1% раствор, 2-10 мин, эффективность хорошая,
удаляется плохо), 70% спирт, диацит.

Величина первичного эксплантата зависит от цели клонального микроразмножения. Если необходимо получить не­большое число растений, свободных от вирусной инфекции, то раз­мер эксплантата не должен превышать 150-250 мкм. Эксплантат та­кого размера представлен меристематическим куполом и 1-2 примордиальными листочками. Установлено, что апикальный купол и близлежащая зона имеют более низкую концентрацию вирусов. Это связано с отсутствием проводящей системы в меристематичсской верхушке. Многие вещества, входящие в питательную среду также ингибируют развитие вирусов. Количество здо­ровых растений увеличивается, если культуру меристематических верхушек сочетать с предварительной термотерапией маточных рас­тений (38°С, 4-8 недель).

Если ставится цель быстро размножить исходные здоровые рас­тения, то применяют культуру верхушек побегов. Размер экспланта­та в этом случае варьируется от 500 мкм до 1 см, и определяется воз­можностью получить стерильную культуру.

В любом случае верхушки после стерилизации промываются 4-5-кратно в стерильной воде (30-50 мин), помещаются в стерильные чашки Петри и заносятся в ламинар-бокс. Ламинар-бокс предвари­тельно стерилизуют ультрафиолетом (за 2 ч до работы), поверхность стола и микроскопа протирают спиртом, включают ламинар-бокс на 15-20 мин.

Верхушку побега помещают стерильным пинцетом на предмет­ный столик микроскопа, на который предварительно кладут стериль­ный фильтр. С помощью глазного скальпеля и иглы проводят выде­ление меристематической верхушки. Для чего верхушку побега рас­полагают основанием к оператору, иглой придерживают основание верхушки, а скальпелем отрезают листочки, постепенно переворачивая верхушку иглой. После удаления 4-6 слоев необходимо осто­рожно и быстро отрезать меристематическую верхушку, состоящую из блестящего купола и субапикальной меристемы. Меристемагическую верхушку с 1-2 примордиальными листочками, поместить на иглу срезом вниз и посадить ее на питательную среду. Если сажают верхушки побегов, то достаточно удалить 1-2 слоя листьев. После посадки фильтр заменяют на новый, инструмент обжигают на спир­товке и помещают в сосуд со спиртом. Руки протирают спиртом. При работе нельзя допускать нахождения рук над предметным столиком микроскопа. После посадки эксплантата пробирки закрывают.

 

Способы размножения растений in vitro

Задание:Приготовить, простерилизовать и разлить питательные среды для размножения и укоренения побе­гов. Разделить конгломерат на отдельные побеги и посадить на пита­тельную среду. Выделить культуры с признаками «стекловидности».

Ход работы: Если культуры (яблоня, ежевика и др.) на первых этапах размно­жения выделяют фенолы, то их размножают на питательных средах, содержащих активированный уголь (0,5-1 г/л) или антиокислители (аскорбиновая кислота, витамин Е, поливинилпиролидон 10-20 мг/л), либо на жидкой среде. Солевой состав питатель­ной среды на первых пассажах должен быть бедным. Целесообразно использовать среды: Андерсона, Мак-Коуна, среду Мурасига-Скуга, в которой количество макро солей уменьшено в 2-4 раза. Перво­начальное поведение эксплантатов зависит от вида, сорта, времени введения в культуру.

Первый этап считается завершенным после по­лучения небольшого конгломерата побегов длиной 0,5-1,5 см. Для ягодных культур требуется затратить 1-3 месяца, для плодовых – 2-5 мес. Содержание цитокининов на первом этапе колеблется от 0,1 до 1 мг/л, ауксинов – от 0,01 до 1 мг/л.

Полученные побеги пере­саживают на питательную среду с большей концентрацией солей и регуляторов роста. Как правило, используют полную среду Мураси­га и Скуга, содержание цитокининов доводят до 1-5 мг/л. Очень ча­сто необходимо корректировать содержание аммиачного и нитратно­го азота. Пересадки необходимо проводить через 3-4 недели либо культуры хранить в холодильнике. Жизнеспособность культур повы­шается, если конгломерат делят на отдельные части, содержащие 3-4 побега, а не один побег. Для некоторых культур оправдано горизон­тальное расположение побегов при очередной пересадке.

Особое внимание необходимо уделить возникновению «стекловидности», или сверховодненности тканей, что можно определить по характерному блеску культур. Такие культуры выбраковываются, а условия культивирования (содержание агара, цитокининов, соотно­шение аммиачного и нитратного азота, колебания температуры) кор­ректируются. Если культуры (яблоня, ежевика и др.) на первых этапах размно­жения выделяют фенолы, то их размножают на питательных средах, содержащих активированный уголь (0,5-1 г/л) или антиокислители (аскорбиновая кислота, витамин Е, поливинилпиролидон 10-20 мг/л), либо на жидкой среде. Солевой состав питатель­ной среды на первых пассажах должен быть бедным. Целесообразно использовать среды: Андерсона, Мак-Коуна, среду Мурасига-Скуга, в которой количество макро солей уменьшено в 2-4 раза. Перво­начальное поведение эксплантатов зависит от вида, сорта, времени введения в культуру.