О путях образования этилового спирта

Изложенные данные позволяют составить определенное представление о том, насколько широко распространено образование этилового спирта среди разных групп эубактерий и насколько различны метаболические пути, ведущие к его синтезу. Из этого следует, что накопление в культуральной среде этилового спирта само по себе не может служить указанием на место процесса, приводящего к его образованию, в эволюции. Этиловый спирт у эубактерий может быть одним из конечных продуктов как эволюционно более ранних (гликолиз), так и более поздних (окислительный пентозофосфатный цикл, путь Энтнера — Дудорова) катаболических процессов. До сих пор среди эубактерий не обнаружены организмы, сохранившие черты примитивности энергетического и конструктивного метаболизма, у которых спиртовое брожение служило бы единственным способом получения энергии. Тот факт, что в самом "классическом" виде спиртовое брожение проявляется у дрожжей, форм эукариотных, не может, как нам кажется, ставить под сомнение его место в эволюции анаэробных энергетических процессов.

ПРОПИОНОВОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

Из рассмотренных двух типов брожения видно, что ключевым соединением в обоих процессах является пируват, поскольку в конечном итоге специфика брожения определяется дальнейшей судьбой пирувата. Основная задача последующих реакций — регенерирование молекулы НАД⁺ и возвращение ее в клеточный метаболизм. Прямое восстановление пирувата с помощью НАД-H₂ до молочной кислоты реализуется в молочнокислом брожении. Другая возможность регенерирования НАД⁺ — "сбрасывание" водорода с НАД-H₂ на фрагменты, образуемые при метаболизме пирувата, — имеет место в спиртовом брожении, осуществляемом дрожжами и некоторыми видами бактерий. Третья возможность связана с синтетическим процессом — усложнением молекулы пирувата, в результате которого создается более окисленная молекула акцептора, способная принять больше электронов с восстановленных переносчиков. Это происходит при присоединении к молекуле пирувата CO₂, приводящем к формированию четырехуглеродного скелета. Процесс получил название гетеротрофной ассимиляции углекислоты.

Рис. 54. Превращение пировиноградной кислоты в пропионовую при пропионовокислом брожении: Ф₁ — метилмалонил-КоА-карбоксилтрансфераза; Ф₂ — малатдегидрогеназа; Ф₃ — фумараза: Ф₄ — фумаратредуктаза; Ф₅ — КоА-трансфераза; Ф₆ — метилмалонил-КоА-мутаза (по Daglev, Nicholson. 1973; Rose. 1971)

Впервые гетеротрофная ассимиляция углекислоты была обнаружена в 1936 г. X. Вудом и К. Веркманом (Н. Wood, C. Werkman) при изучении сбраживания глицерина пропионовыми бактериями. Карбоксилирование пирувата, приводящее к образованию щавелевоуксусной кислоты, получило название реакции Вуда — Веркмана. У эубактерий обнаружены различные реакции карбоксилирования пирувата или его фосфорилированного производного. Показано, что реакции карбоксилирования имеют место у всех гетеротрофных прокариот, а также в клетках всех эукариотных организмов, включая высшие растения и животных. Кроме того, в больших масштабах в природе реакции связывания CO₂ осуществляются автотрофными. организмами в процессе хемо- и фотосинтеза.

В пропионовокислом брожении мы имеем дело с реализацией третьей возможности превращения пирувата — его карбоксилированием, приводящим к возникновению нового акцептора водорода — ЩУК. Восстановление пировиноградной кислоты в пропионовую у пропионовокислых бактерий протекает следующим образом (рис. 54). Пировиноградная кислота карбоксилируется в реакции, катализируемой биотинзависимым ферментом, у которого биотин выполняет функцию переносчика CO₂. Донором CO₂-группы служит метилмалонил-КоА. В результате реакции транскарбоксилирования образуются ЩУК и пропионил-КоА:

Рассмотрим теперь дальнейшую судьбу каждого из двух продуктов реакции, а также вопрос о происхождении одного из субстратов реакции — метилмалонил-КоА. (Основным источником пировиноградной кислоты служит процесс гликолитического расщепления гексоз или окислительные превращения, если в качестве субстрата брожения используют, например, диоксиацетон или глицерин.)

ЩУК в результате трех ферментативных этапов (аналогичных реакциям 6, 7, 8 цикла трикарбоновых кислот, см. рис. 92) превращается в янтарную кислоту:

Следующая реакция заключается в переносе КоА-группы с пропионил-КоА на янтарную кислоту (сукцинат), в результате чего образуется сукцинил-КоА и пропионовая кислота:

Образовавшаяся пропионовая кислота выводится из процесса и накапливается вне клетки. Сукцинил-КоА превращается в метилмалонил-КоА:

В состав кофермента метилмалонил-КоА-мутазы входит витамин B₁₂. Перегруппировки типа, указанного в приведенном выше уравнении, характерны для реакций, катализируемых ферментами, содержащими витамин B₁₂. В описанной выше реакции происходящие перемещения атомов в молекуле сводятся к двум типам: изменению углерод-углеродных связей и перераспределению водорода между углеродными атомами (рис. 55). Реакция, катализируемая мутазой, — ключевая в пропионовокислом брожении, так как в ней подготавливается субстрат, являющийся предшественником пропионовой кислоты.

Из схемы, представленной на рис. 54, можно видеть, что образование пропионовой кислоты из пировиноградной — результат взаимосвязанного функционирования двух циклов: цикла переноса одноуглеродного фрагмента и цикла переноса кофермента А.

Рис. 55. Механизм реакции, катализируемой метилмалонил-КоА-мутазой. Цифрами в кружочках пронумерованы атомы углерода

Кофермент А, принимающий активное участие в пропионовокислом брожении, относится к группе мононуклеотидов. Он содержит аденин, Д-рибозу, пирофосфатную группу и пептидоподобное соединение, в состав которого входит пантотеновая кислота — еще один витамин группы В. Функция кофермента А заключается в переносе ацильных групп (RCO~). Ацильная форма КоА представляет собой тиоэфир. Тиоэфирная связь, образующаяся между карбоксильной группой кислоты и тиоловой группой КоА, является высокоэнергетической.

Итак, разобранный выше поток реакций приводит к синтезу пропионовой кислоты. Однако пропионовокислое брожение — более сложный процесс, поскольку наряду с пропионовой кислотой в качестве продуктов брожения образуются уксусная, янтарная кислоты и CO₂. В схеме, изображенной на рис. 54, янтарная кислота образуется как промежуточное соединение на пути, ведущем к синтезу пропионата; но она может накапливаться в среде и как конечный продукт. К образованию сукцината, количество которого зависит от содержания CO₂ в среде, ведет последовательность реакций, начинающаяся с карбоксилирования ФЕП (рис. 56), в которой остаток фосфорной кислоты ФЕП переносится на неорганический фосфат, что приводит к образованию пирофосфата:

ФЕП + CO₂ + Ф_Н  ЩУК + пирофосфат.

Дальнейшие превращения ЩУК до янтарной кислоты аналогичны реакциям 2 — 4, изображенным на рис. 54.

Многие пропионовые бактерии сбраживают глюкозу так, что на каждую молекулу пирувата, окисленную до уксусной кислоты и CO₂, приходятся 2 молекулы пирувата, восстановленные до пропионовой кислоты. Путь превращения пирувата, приводящий к образованию уксусной кислоты и CO₂, представлен на рис. 56. На этом пути имеют место окислительно-восстановительные реакции, идущие с вовлечением новых молекул НАД⁺. Пируват подвергается окислительному декарбоксилированию с участием кофермента А:

Процесс катализируется пируватдегидрогеназным комплексом и практически необратим. В результате образуется ацетил-КоА, содержащий высокоэнергетическую тиоэфирную связь, ацетильная группа с которого переносится на неорганический фосфат, что приводит к образованию ацетилфосфата и регенерированию кофермента А:

Рис. 56. Пути образования янтарной, уксусной кислот и CO₂ пропионовыми бактериями: Ф₁ — ФЕП-карбокситрансфосфорилаза; Ф₂ — пируватдегидрогеназа; Ф₃ — фосфотрансацетилаза; Ф₄ — ацетаткиназа

В этой реакции энергия, заключенная в тиоэфирной связи, реализуется в виде высокоэнергетической фосфатной связи ацетилфосфата.

И наконец, ацетилфосфат донирует фосфатную группу на АДФ с образованием АТФ и уксусной кислоты:

Итак, на участке от пирувата до ацетата образуется 1 молекула НАД-H₂ и 1 молекула АТФ. Энергетическое значение для пропионовых бактерий этого участка метаболического пути очевидно и не требует обсуждения.

Кроме основных продуктов в разных количествах в культуральной жидкости пропионовых бактерий обнаружены молочная, муравьиная, изовалериановая кислоты, этиловый и пропиловый спирты, уксусный и пропионовый альдегиды, ацетоин, диацетил. Состав конечных продуктов брожения зависит от культуры бактерий, состава среды и условий культивирования. Это касается как видов накапливаемых продуктов, так и количественных соотношений между ними.

Теоретически пропионовое брожение должно приводить к образованию 4 молекул АТФ при сбраживании 1,5 молекулы глюкозы. Однако было обнаружено, что выход энергии несколько выше. Источником дополнительных молекул АТФ, возможно, является этап восстановления фумаровой кислоты до янтарной, катализируемый фумаратредуктазой (см. рис. 54). Получены экспериментальные данные в пользу того, что восстановление фумарата до сукцината — процесс, в результате которого некоторые первично анаэробные эубактерии могут синтезировать АТФ по механизму фосфорилирования, сопряженного с переносом электронов. Показано, что фумаратредуктаза связана с мембраной и образует комплекс с переносчиком электронов хиноном. В составе комплекса обнаружен цитохром b. Фумаратредуктазная система найдена у пропионовых бактерий. Этой системе придается большое значение в эволюции как, возможно, первому шагу на пути создания многокомпонентных электронтранспортных цепей у эубактерий (см. гл. 15).

Энергетическая эффективность пропионовокислого брожения связана также с выработкой пропионовыми бактериями новых метаболических способностей: реакций транскарбоксилирования и перегруппировки, участия в процессе КоА-производных. Образование дикарбоновой кислоты из пировиноградной с использованием механизма транскарбоксилирования вместо прямого карбоксилирования пирувата позволяет избежать дополнительных энергетических затрат на этом этапе брожения. Все это вместе взятое позволяет рассматривать пропионовокислое брожение как более совершенный из рассмотренных до сих пор способов получения энергии в анаэробных условиях.

ПРОПИОНОВОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ

В эту группу, объединяемую в род Propionibacterium, входят грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, размножающиеся бинарным делением. В зависимости от условий культивирования и цикла развития форма клетки может меняться до кокковидной, изогнутой или булавовидной. Типовой вид — P. freudenreichii.

Большинство пропионовокислых бактерий — аэротолерантные анаэробы, получающие энергию в процессе брожения, основным продуктом которого является пропионовая кислота. Аэротолерантность их обусловлена наличием полностью сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода). У пропионовокислых бактерий обнаружены супероксиддисмутазная, каталазная и пероксидазная активности. Внутри группы отношение к O₂ различно. Некоторые виды могут расти в аэробных условиях.

Брожение не исчерпывает всех возможностей получения энергии этой группой эубактерий. Хотя гликолитическое расщепление глюкозы с образованием в качестве обязательного промежуточного соединения пировиноградной кислоты является основным путем разложения глюкозы, кроме этого пути в группе пропионовых бактерий обнаружен окислительный пентозофосфатный путь, реакции ЦТК, активное "флавиновое дыхание" и окислительное фосфорилирование, сопряженное с электрон-транспортной системой. Вклад каждого из этих путей в общий энергетический метаболизм зависит как от вида бактерий, так и от конкретных внешних условий. Эволюция пропионовых бактерий определенно шла по пути приспособления к аэробным условиям. У некоторых видов обнаружен "эффект Пастера": в присутствии кислорода воздуха происходит переключение с брожения на дыхание. Пропионовые бактерии могут синтезировать гемсодержащие белки. В их клетках обнаружены цитохромы.

Важную роль в аэробном метаболизме пропионовых бактерий играет "флавиновое дыхание", которому приписывают основную связь этих бактерий с молекулярным кислородом. В процессе "флавинового дыхания" происходит перенос двух электронов с флавопротеинов на O₂, сопровождающийся образованием перекиси водорода, которая разлагается бактериальной каталазой и пероксидазой. Однако "флавиновое дыхание" не связано с получением клеткой энергии. Транспорт электронов в дыхательной цепи некоторых пропионовых бактерий сопровождается образованием АТФ, что может указывать на подключение к этому процессу цитохромов, однако эффективность окислительного фосфорилирования низка. Последнее, вероятно, объясняется несовершенством механизмов сопряжения. В то время как в аэробных условиях конечным акцептором электронов с НАД-H₂ является O₂, в анаэробных условиях им может быть нитрат, фумарат.

Таким образом, в группе пропионовых бактерий мы впервые при рассмотрении эубактериальных форм сталкиваемся с большим разнообразием энергетических возможностей. В целом у пропионовых бактерий достаточно четко просматриваются две тенденции: с одной стороны, усовершенствование основного анаэробного способа получения энергии, с другой — попытки приспособления и, более того, рационального использования молекулярного кислорода.

Конструктивный метаболизм пропионовых бактерий претерпел дальнейшую эволюцию в сторону большей независимости от органических соединений внешней среды. Пропионовые бактерии характеризуются хорошо развитыми биосинтетическими способностями и могут расти на простой синтетической среде с аммонийным азотом в качестве единственного источника азота при добавлении к среде пантотеновой кислоты и биотина, а для некоторых видов и тиамина. У ряда пропионовых бактерий обнаружена способность к азотфиксации.

Местообитание пропионовых бактерий — кишечный тракт жвачных животных, молоко, твердые сыры, в приготовлении которых они принимают участие. После молочнокислого брожения, когда лактоза превращена в молочную кислоту, начинают размножаться Пропионовые бактерии, сбраживающие молочную кислоту с образованием уксусной и пропионовой кислот. Эти кислоты придают сырам специфический острый вкус. Пропионовые бактерии используют в микробиологической промышленности в качестве продуцентов витамина B₁₂.

МАСЛЯНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ

Рис. 57. Пути превращения пирувата в маслянокислом брожении, осуществляемом Clostridium butyricum: Ф₁ — пируват:ферредоксиноксидоредуктаза; Ф₂ — ацетил-КоА-трансфераза (тиолаза); Ф₃ — (3-оксибутирил-КоА-дегидрогеназа; Ф₄ — кротоназа; Ф₅ — бутирил-КоА-дегидрогеназа; Ф₆ — КоА-трансфераза; Ф₇ — фосфотрансацетилаза; Ф₈ — ацетаткиназа; Ф₉ — гидрогеназа; Фд_ок — окисленный; Фд-H₂ — восстановленный ферредоксин; Ф_Н — неорганический фосфат

Следующий вариант решения донор-акцепторной проблемы на базе гликолитически образованного пирувата представляет собой маслянокислое брожение. Новое в маслянокислом брожении — возникновение реакций конденсации типа С₂ + С₂  С₄, в результате чего образуется С₄-акцепторная кислота. Судьба этой кислоты различна и определяется необходимостью акцептирования водорода с НАД-H₂, освобождающегося в процессе брожения, а это в свою очередь тесно связано с оттоком водорода на конструктивные процессы. В качестве конечных C₄-продуктов в процессе брожения возникают соединения различной степени восстановленности. Характерным C₄-продуктом брожения является масляная кислота. Осуществляют такой тип брожения многие бактерии, относящиеся к роду Clostridium.

Типичными представителями клостридиев, осуществляющих маслянокислое брожение, являются C. butyricum и C. pasteurianum. Они сбраживают сахара с образованием масляной и уксусной кислот, CO₂ и H₂ (рис. 57). Превращение глюкозы до пирувата осуществляется по гликолитическому пути. Следующая реакция — разложение пирувата до ацетил-КоА и CO₂, сопровождающееся образованием восстановленного ферредоксина (Фд). Реакция катализируется ферментом пируват: ферредоксиноксидоредуктазой и является ключевой в маслянокислом брожении. Особенности реакции — участие в ней белков, содержащих негемовое железо и кислотолабильную серу (FeS-белки)⁴⁵.

⁴⁵ Кислотолабильной она названа потому, что при кислотной обработке белка происходит ее выделение в виде H₂S.

К FeS-белкам относится группа белков, участвующих в процессах электронного транспорта (ферредоксины), и ряд ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Установлено, что FeS-белки являются ключевыми в таких важных клеточных процессах, как фотосинтез, дыхание, азотфиксация, фиксация CO₂.

Отличительная особенность FeS-белков — строение их активного центра, содержащего негемовое железо, связанное нековалентными связями с кислотолабильной серой и серой, входящей в состав цистеиновых остатков пептидной цепи. Разные типы железосероцентров (FeS-центры) широко распространены в клетках. Простейший из них содержит один атом железа, нековалентно связанного в молекуле белка, получившего название рубредоксина, с четырьмя остатками цистеина (рис. 58, А)

Рис. 58. Железосероцентры FeS-белков. Железосероцентр рубредоксина (А); предполагаемые модели железосероцентров Fe₂S₂-типа (Б) и Fe₄S₄-типа (В). Звездочкой отмечена неорганическая кислотолабильная сера; прерывистой линией обозначена полипептидная цепь; цис — цистеин

Обнаруженный у C. pasteurianum рубредоксин имеет окислительно-восстановительный потенциал около — 57 мВ и участвует в реакциях одноэлектронного переноса, в основе которого лежит переход железа:

Fe²⁺  Fe³⁺.

Остальные FeS-белки имеют более сложно организованные FeS-центры, в состав которых входит также неорганическая кислотолабильная сера. Известны Fe₂S₂-центры (содержат по два атома железа и неорганической серы), Fe₃S₃- и Fe₄S₄-центры (рис. 58, Б, В). FeS-белки могут содержать один или более центров в молекуле. У большинства FeS-содержащих ферментов помимо FeS-центров в молекуле имеются и иные кофакторы: металлы (молибден, селен), хромофорные группы (флавин, гемы, птеридины), витамины (табл. 16).

Клостридии содержат ферредоксины с 1 — 2 центрами Fe₄S₄-типа и молекулярной массой 6000 — 7000 Да.

В зависимости от особенностей строения FeS-центров ферредоксины могут осуществлять одновременный перенос одного или двух электронов. Окислительно-восстановительный потенциал ферредоксинов находится в диапазоне от — 490 до — 310 мВ, однако описаны FeS-белки, окислительно-восстановительный потенциал которых высоко положителен (около + 350 мВ).

Ферредоксины играют центральную роль в метаболизме клостридиев, сопрягая катаболические процессы с биосинтетическими реакциями (рис. 59).

Таблица 16. Железосеросодержащие ферменты эубактерий

Простетическая группа	Ферменты
FeS-центры	гидрогеназа и др.
FeS-центры + тиаминпирофосфат	пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза
FeS-центры + флавин	сукцинатдегидрогеназа, НАД(Ф)-H₂-дегидрогеназа, глутаматсинтетаза и др.
FeS-центры + гем	диссимиляционная сульфитредуктаза
FeS-центры + молибден	нитрогеназа, диссимиляционная нитратредуктаза, формиатдегидрогеназа и др.
FeS-центры + два и более дополнительных кофактора	ассимиляционная сульфитредуктаза, ксантиндегидрогеназа и др.

Рис. 59. Роль ферредоксина в метаболизме клостридиев: 1 — пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза; 2 — гидрогеназа; 3 — ферредоксин: НАД (Ф)-оксидоредуктаза; 4 — формиатдегидрогеназа; 5 — ксантиндегидрогеназа; 6 — нитрогеназа; 7 — ферредоксин:CO₂-оксидоредуктаза (возможно, это формиатдегидрогеназа, катализирующая реакцию 4 в обратном направлении); 8 — реакция 3, протекающая в обратном направлении; 9 — сульфатредуктаза; 10 — реакция 1, протекающая в обратном направлении; 11 — нитратредуктаза

Объясняется это тем, что у клостридиев (как и других облигатных анаэробов) физиологические реакции в клетке всегда протекают при отрицательных окислительно-восстановительных потенциалах. В этих условиях FeS-белки, имеющие общий отрицательный окислительно-восстановительный потенциал, особенно пригодны для функционирования в составе ферментов и в качестве переносчиков электронов.

Образующийся в реакции восстановленный ферредоксин поставляет электроны для восстановления N₂, протонов (H⁺), CO₂ и НАДФ⁺, а последующее превращение ацетил-КоА приводит к синтезу АТФ в реакции субстратного фосфорилирования.

Путь, ведущий к синтезу масляной кислоты, начинается с реакции конденсации двух молекул ацетил-КоА (см. рис. 57). Образовавшийся ацетоацетил-КоА восстанавливается в -оксибутирил-КоА. Источником электронов в этой реакции и дальше на пути синтеза масляной кислоты служат молекулы НАДxH₂, образующиеся при окислении 3-ФГА в 1,3-ФГК (см. рис. 53).

Дальнейшее превращение заключается в отщеплении от молекулы (3-оксибутирил-КоА молекулы воды, что приводит к образованию соединения с двойной углеродной связью. Кротонил-КоА ферментативно восстанавливается в бутирил-КоА. Масляная кислота образуется в реакции переноса кофермента А с молекулы бутирил-КоА на ацетат. Эта реакция более "выгодна" для клетки, так как не приводит к потере энергии (в отличие от реакции простого гидролиза). Образующийся в реакции ацетил-КоА возвращается в метаболический поток и может быть использован для синтеза АТФ (реакция 7 на рис. 57) или же вновь участвовать в последовательности реакций, ведущих к синтезу масляной кислоты (реакции 2 — 6, там же).

Разобранный выше путь, завершающийся синтезом масляной кислоты, не связан с получением клеткой энергии, поскольку ни на одном из этапов не происходит образования АТФ. Единственное назначение метаболических превращений ацетил-КоА по этому пути — акцептирование электронов, переносимых на НАД⁺ в процессе гликолитического метаболизирования глюкозы: две молекулы НАД-H₂ образуются на этапе гликолиза, и на двух этапах превращений ацетил-КоА до масляной кислоты происходит потребление водорода с НАД-H₂.

В связи с этим особо важное значение приобретает превращение ацетил-КоА, ведущее к синтезу ацетата, поскольку именно с этим путем связано дополнительное получение клостридиями энергии в процессе маслянокислого брожения. Процесс включает несколько ферментативных реакций (см. рис. 57). Сначала имеет место окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты, катализируемое пируват:ферредоксиноксидоредуктазой. Далее с помощью гидрогеназы происходит выделение молекулярного водорода с восстановленного ферредоксина.

Гидрогеназы — одна из групп FeS-содержащих ферментов, катализирующих реакции поглощения и выделения молекулярного водорода, обнаружены у разных групп эубактерий: облигатных анаэробов и аэробов, факультативных форм, у хемо- и фототрофных организмов. Различаются строением молекулы, природой доноров и акцепторов электронов, с которыми взаимодействуют, локализацией в клетке, выполняемыми функциями. Но все гидрогеназы катализируют реакцию H₂  2H⁺ + 2e^–.

Гидрогеназа C. pasteurianum, один из наиболее детально изученных ферментов, — белок с молекулярной массой примерно 60 000 Да, представленный одной субъединицей. В молекуле содержатся три центра типа Fe₄S₄. Донором (акцептором) электронов клостридиальной гидрогеназы служит ферредоксин.

При разрушении клеток C. pasteurianum гидрогеназная активность проявляется только в растворимой фракции: в периплазматическом пространстве и цитоплазме. Гидрогеназа, локализованная в периплазматическом пространстве, катализирует необратимую реакцию поглощения H₂. Находящаяся в цитоплазме гидрогеназа способна катализировать реакции как поглощения, так и выделения H₂. У клостридиев она входит в состав ферментного комплекса, осуществляющего окислительное декарбоксилирование пирувата (см. рис. 57).

Основная функция гидрогеназ клостридиев (и других облигатных анаэробов) заключается в избавлении от избытка образующихся в катаболических реакциях восстановительных эквивалентов (электронов), которые переносятся на H⁺ и удаляются из клетки в виде молекулярного водорода.

Гидрогеназы других эубактерий могут иметь более сложное строение: состоять из нескольких неидентичных субъединиц, содержать помимо FeS-центров флавины в качестве простетических групп. Помимо ферредоксинов гидрогеназы разных организмов могут взаимодействовать с довольно широким набором переносчиков электронов: цитохромами c, НАД (Ф), хинонами и др.

В то время как поглощение На происходит только с участием гидрогеназ, выделение молекулярного водорода у эубактерий, способных к фиксации N₂, наряду с гидрогеназой может катализироваться и нитрогеназой. Согласно одной из точек зрения, гидрогеназы возникли в результате усложнения структуры ферредоксинов.

Ацетил-КоА превращается в ацетилфосфат, а затем в ацетат, при этом синтезируется молекула АТФ. Две последние реакции аналогичны тем, которые происходят при образовании уксусной кислоты в пропионовокислом брожении (см. рис. 56).

Основным источником выделяемых при брожении газообразных продуктов (CO₂ и H₂) служит реакция окислительного декарбоксилирования пирувата. У клостридиев описаны и другие пути образования молекулярного водорода. В частности, НАД-H₂, возникающий на гликолитическом пути, может восстанавливать ферредоксин в реакции, катализируемой НАД-H₂:ферредоксиноксидоредуктазой, а с восстановленного ферредоксина H₂ выделяется при участии гидрогеназы. Как видно, природа нашла различные пути для избавления от избытка восстановительных эквивалентов и для регенерирования и последующего возвращения в клеточный метаболизм промежуточных переносчиков водорода.

Выведение уравнения маслянокислого брожения и определение его энергетического выхода затруднительно из-за лабильности процесса, состоящего из двух основных ответвлений: одного — окислительного, ведущего к образованию ацетата и АТФ, другого — восстановительного, функция которого — акцептирование водорода, образовавшегося в процессе гликолиза. Количественное соотношение между обоими ответвлениями зависит от многих внешних факторов (состав среды, стадия роста и др.).

Расчеты показали, что в целом на 1 моль сбраживаемой глюкозы в маслянокислом брожении образуется 3,3 моля АТФ. Это наиболее высокий энергетический выход брожения, т. е. получения энергии за счет субстратного фосфорилирования, из всех рассмотренных выше типов брожений.

Некоторые клостридии (C. acetobutylicum, C. bejerinckii, C. cellobioparum и др.) при сбраживании сахаров наряду с кислотами накапливают в среде нейтральные продукты (бутиловый, изопропиловый, этиловый спирты, ацетон). Особенно много нейтральных продуктов образуется культурой C. acetobutylicum, что дало основание в свое время выделить как вариант маслянокислого брожения ацетоно-бутиловое брожение. У клостридиев, осуществляющих ацетоно-бутиловое брожение, образование масляной кислоты происходит на первом этапе брожения. По мере подкисления среды (до pH ниже 5) и повышения в ней концентрации жирных кислот индуцируется синтез ферментов, приводящих к накоплению нейтральных продуктов, в первую очередь н-бутанола и ацетона. н-Бутанол образуется из бутирил-КоА, предшественника масляной кислоты, в результате двух последовательных ферментативных реакций (рис. 60). Первая из них заключается в отщеплении кофермента А и одновременном гидрировании, приводящем к образованию масляного альдегида. Последующее его восстановление с помощью НАД-H₂ приводит к появлению н-бутанола. Путь, ведущий к образованию ацетона, начинается с переноса от ацетоацетил-КоА кофермента А на ацетат. Декарбоксилирование ацетоуксусной кислоты приводит к образованию ацетона. Образование этанола происходит в результате двухступенчатого восстановления ацетил-КоА.

Рис. 60. Образование нейтральных продуктов при маслянокислом брожении: Ф₁ — бутирилальдегиддегидрогеназа; Ф₂ — бутанолдегидрогеназа; Ф₃ — КоА-трансфераза; Ф₄ — ацетоацетатдекарбоксилаза; Ф₅ — изопропанолдегидрогеназа; Ф₆ — ацетальдегиддегидрогеназа; Ф₇ — алкогольдегидрогеназа

Физиологический смысл дополнительных ферментативных этапов у C. acetobutylicum, ведущих к накоплению в среде н-бутанола, этанола и ацетона, заключается в образовании конечных продуктов нейтрального характера. Первоначально нейтральный pH среды вследствие накопления масляной и уксусной кислот быстро падает. Некоторые клостридии выработали механизм борьбы с нарастающей кислотностью, который начинает функционировать при низком pH среды и приводит к появлению перечисленных выше нейтральных продуктов. Одновременно происходит понижение общей кислотности среды, что также свидетельствует об активном противодействии этих бактерий неблагоприятным условиям.

Изучение физиологии группы клостридиев, осуществляющих ацетоно-бутиловое брожение, привело к открытию В. Н. Шапошниковым (1884 — 1968) явления двухфазности этого процесса, которое позднее было обнаружено в большинстве типов брожений, характеризующихся сложным набором конечных продуктов. В основе явления двухфазности лежит тесная связь между конструктивными и энергетическими процессами. Вначале, когда имеет место активный рост культуры, сопровождающийся интенсивными биосинтетическими процессами, происходит значительный отток образующегося при брожении восстановителя для конструктивных целей. Это сопровождается преобладающим синтезом более окисленных конечных продуктов брожения (I фаза). При затухании роста и переходе культуры в стационарное состояние уменьшается потребность в восстановителе для конструктивных целей. Последнее приводит к большему его использованию в энергетических процессах и, следовательно, к образованию более восстановленных конечных продуктов брожения (II фаза). Таким образом, масштабы конструктивного метаболизма определяют характер и направление энергетических процессов.

Как можно оценить возникшую у маслянокислых бактерий последовательность ферментативных реакций, ведущих к синтезу масляной кислоты, а также дополнительные ферментативные этапы, ведущие к синтезу н-бутанола и ацетона? На пути от ацетил-КоА до масляной кислоты в двух точках имеет место акцептирование водорода с НАД-H₂. Синтез н-бутанола из бутирил-КоА связан еще с двумя восстановительными этапами. Итак, образование н-бутанола вызвано не только противодействием нарастающей кислотности. Этот дополнительно развившийся участок пути весьма эффективен в качестве ферментативных преобразований, связанных с утилизацией возникающих в процессе брожения молекул НАД-H₂.

Рассмотрим под этим же углом зрения путь, ведущий к синтезу ацетона. Метаболизирование части ацетоацетил-КоА через ацетоуксусную кислоту в ацетон приводит к определенной потере потенциальных акцепторов водорода, которые могли бы на пути к образованию масляной кислоты или н-бутанола присоединить соответствующее количество водорода с НАД-H₂. Однако этот путь является более коротким путем образования нейтральных продуктов, что, вероятно, для бактерий в определенных условиях выгодно. Кроме того, попыткой как-то компенсировать этот недостаток можно объяснить возникновение у некоторых видов клостридиев способности ферментативно восстанавливать ацетон в изопропанол с использованием водорода с НАД-H₂.

С точки зрения решения обеих проблем (нейтрализация среды и акцептирование восстановительных эквивалентов, образующихся при гликолизе), наиболее эффективен путь, ведущий к синтезу этанола, на двух этапах которого происходит акцептирование водорода с НАД-H₂. Некоторые клостридии в качестве одного из нейтральных продуктов образуют значительные количества этанола.

БАКТЕРИИ РОДА Clostridium

К клостридиям относят большое количество видов бактерий, число которых постоянно возрастает. Это один из самых крупных родов среди эубактерий. Принадлежность к роду определяется на основании только трех признаков: 1) способности образовывать эндоспоры; 2) облигатно анаэробного характера энергетического метаболизма; 3) неспособности осуществлять диссимиляционное восстановление сульфата. Отсюда понятно, что эта таксономическая группа эубактерий чрезвычайно гетерогенна, о чем, в частности, свидетельствует интервал значений ГЦ-оснований ДНК, молярное содержание которых с учетом описанных новых видов занимает область от 21 до 57%.

Из этого можно также сделать вывод, что организмы, объединяемые в род Clostridium, нельзя рассматривать как эволюционно однотипные. Последующая характеристика их метаболических особенностей дает достаточно четкое представление об этом. Изучение эубактерий, относимых к клостридиям, наоборот, указывает на раннее расхождение видов рода в процессе эволюции.

Рис. 61. Процесс спорообразования у клостридиев: 1 — молодые вегетативные клетки; 2 — клетки, находящиеся в стационарной фазе; 3, 4 — стадии спорообразования; 5 — клетки с созревшими спорами (по Иерусалимскому, 1963)

За исключением C. coccoides, вегетативные клетки бактерий из рода Clostridium имеют форму прямых или слегка изогнутых палочек с закругленными концами (рис. 61). Большинство видов грамположительные, подвижные. Движение осуществляется с помощью перитрихиально расположенных жгутиков. По мере старения в процессе цикла развития клетки теряют подвижность, накапливают гранулезу (запасное вещество типа крахмала) и переходят к спорообразованию. Образующиеся споры овальной или сферической формы. Диаметр их, как правило, превышает диаметр вегетативной клетки, поэтому, если формирующаяся спора расположена в центре клетки, последние меняют форму, становясь веретеновидными (рис. 61); если же споры образуются у одного из клеточных концов, клетки приобретают форму барабанных палочек.

Клостридии — облигатные анаэробы. Однако спектр их чувствительности к молекулярному кислороду достаточно широк, что связано с обнаружением в клетках большинства клостридиев супероксиддисмутазы и с другими приспособлениями на уровне клеточных популяций, помогающими нейтрализовать токсические эффекты O₂ и его производных. Именно при работе с клостридиями Л. Пастер в 1861 г. открыл форму жизни без кислорода.