Б. Соскоб со дна везикулы

1.Делают надрез скальпелем по периферии везикулы.

2.Приподнимают отслоившийся эпидермис и удаляют жидкость с помощью тампона.

3.Скальпелем делают соскоб со дна везикулы. При этом следует избегать кровотечения.

4.Полученный материал переносят на 2 чистых предметных стекла и делают 2 мазка диаметром 5—10 мм.

5.Мазки высушивают на воздухе и фиксируют спиртом.

6.Фиксированные мазки окрашивают по Гимзе или обрабатывают антителами, меченными флюоресцентным красителем.

7.Для получения надежных результатов соскоб производят трижды.

В. Продукцию антител к вирусным антигенамможно оценить с помощью реакции нейтрализации, реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента и твердофазного ИФА. Пробы крови (2—10 мл) забирают на ранней стадии заболевания и спустя 2—3 нед. В стерильных условиях получают сыворотку, помещают ее в стерильную пробирку и до отправки в лабораторию хранят в холодильнике или замораживают (–20°C). Диагностически значимым считается четырехкратное повышение титра антител в ходе заболевания.

1. Реакция связывания комплемента(см. гл. 22, п. III.Д).

2. Реакция нейтрализации — высокоспецифичный метод, основанный на связывании вируса антителами и его нейтрализации. Метод позволяет определить уровень противовирусных антител и способность исследуемой сыворотки нейтрализовать вирусы. Суть метода заключается в следующем: 1) производят серийные разведения исследуемой сыворотки; 2) разные разведения сыворотки смешивают с известным количеством вируса; 3) сыворотку добавляют к культуре клеток, восприимчивой к данному вирусу; 4) нейтрализующую активность сыворотки оценивают по снижению способности вирусов инфицировать культуру клеток.

3. Реакция торможения гемагглютинации — высокоспецифичный и чувствительный метод, позволяющий определить даже незначительное количество противовирусных антител в биологических жидкостях. Этот метод основан на способности некоторых вирусов сорбироваться на эритроцитах, в частности на человеческих эритроцитах группы 0 и куриных эритроцитах, и вызывать гемагглютинацию. Если исследуемая биологическая жидкость содержит противовирусные антитела, при ее добавлении к вирусам будет наблюдаться торможение гемагглютинации. Чем выше содержание противовирусных антител в исследуемой жидкости, тем сильнее подавляется гемагглютинация.

Г. Для экспресс-диагностики вирусных инфекцийприменяют серологические методы, основанные на применении стандартных противовирусных антител. Эти методы перечислены ниже.

1.РИА.

2.Иммунофлюоресцентный анализ.

3.Твердофазный ИФА.

Д. Инфекционный мононуклеозвызывает вирус Эпштейна—Барр. Заболевание обычно возникает в детском и молодом возрасте. К характерным проявлениям инфекционного мононуклеоза относятся лихорадка, боль в горле, увеличение лимфоузлов, спленомегалия, лимфоцитоз. Поскольку сходная клиническая картина наблюдается также при цитомегаловирусной инфекции, бруцеллезе, туляремии, остром токсоплазмозе и на ранних стадиях краснухи, для диагностики инфекционного мононуклеоза используют серологические методы.

1. Гетерофильные антитела — IgM, взаимодействующие с антигенами животных неродственных видов, например барана или быка. Эти антитела выявляются примерно у 90% больных инфекционным мононуклеозом. Гетерофильные антитела в низком титре могут присутствовать и у здоровых людей.

а. Проба Пауля—Буннелля — стандартный метод лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза. Он заключается в выявлении гетерофильных антител к эритроцитам барана с помощью реакции гемагглютинации. Гетерофильные антитела при инфекционном мононуклеозе отличаются от гетерофильных антител, присутствующих в сыворотке здоровых и больных сывороточной болезнью, по способности абсорбироваться тканью почек морской свинки и эритроцитами быка (см. табл. 22.3). Диагностически значимым считается титр 1:128—1:256. Гетерофильные антитела обычно обнаруживают через 3—4 нед после начала заболевания. Реакция Пауля—Буннелля бывает положительной при лейкозах, вирусных гепатитах, цитомегаловирусной инфекции, лимфоме Беркитта, ревматоидном артрите и после введения иммунных сывороток. Титр антител не отражает тяжести заболевания, однако при измерении в динамике позволяет следить за течением заболевания.

б. Экспресс-тест на гетерофильные антитела (Моно-Тест, Уэмпоул Лэборэтрис). Гетерофильные антитела в этом исследовании выявляются при агглютинации стабилизированных формалином эритроцитов лошади. Абсорбцию тканью почек морской свинки и эритроцитами быка не проводят.

2. Специальные серологические методы. Инфекционный мононуклеоз не всегда сопровождается появлением гетерофильных антител. Они, в частности, отсутствуют у детей. В этом случае применяют следующие серологические методы.

а. Антитела к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр выявляют методом иммунофлюоресценции. На ранней стадии заболевания в сыворотке больного появляются IgM к капсидному антигену. Их титр становится максимальным через 2 нед после начала заболевания и снижается в течение 2—3 мес. Присутствие IgM к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр свидетельствует о недавнем заражении, а IgG — о ранее перенесенном заболевании.

б. Антитела к ранним антигенам вируса Эпштейна—Барр выявляются методом непрямой иммунофлюоресценции. Титр этих антител становится максимальным через 2—3 нед после начала заболевания.

в. Антитела к ядерному антигену вируса Эпштейна—Баррвыявляются методом непрямой иммунофлюоресценции с применением комплемента и меченых антител к нему. Антитела к ядерному антигену появляются примерно через 4 нед после начала заболевания и сохраняются на протяжении всей жизни.

Е. Вирусные гепатиты— системные инфекционные заболевания, проявляющиеся преимущественным поражением печени. Их вызывают вирусы гепатитов A, B, C, D, E, вирус Эпштейна—Барр, цитомегаловирус, вирус varicella-zoster, аденовирусы.

1. Вирус гепатита A — РНК-содержащий вирус размером 27 нм. Наиболее достоверный лабораторный признак заболевания — выявление IgM к вирусу гепатита A с помощью РИА или твердофазного ИФА. Реже используется модификация метода гемагглютинации, основанная на агглютинации эритроцитов при добавлении к ним вируса и сыворотки (источник комплемента и противовирусных антител). Диагностически значимым считается четырехкратное повышение титра противовирусных антител в течение 4 нед. Выявление вирусов в кале проводят с помощью электронной микроскопии проб, обработанных противовирусными антителами.

2. Вирус гепатита Bсодержит двухцепочечную ДНК, окруженную нуклеокапсидом размером 27 нм, в состав которого входит HBcAg, и внешней оболочкой, содержащей HBsAg. HBsAg обнаруживается в крови за 6 нед до появления симптомов заболевания и может выявляться длительное время как при их наличии, так и в их отсутствие (при хроническом гепатите и носительстве). На ранних стадиях заболевания этот антиген обнаруживается у 90—95% больных. Антитела к HBsAg появляются в сыворотке через 2—26 нед после исчезновения HBsAg, выявление этих антител свидетельствует о выздоровлении и развитии иммунитета. Антитела к HBcAg появляются в крови в острой стадии заболевания. Даже однократное выявление этих антител в сыворотке с высокой вероятностью указывает на острый гепатит, вызванный вирусом гепатита B. У лиц, в сыворотке которых после выздоровления длительное время сохраняется HBsAg, часто выявляются и антитела к HBcAg. Третий антиген вируса гепатита B — HBeAg — появляется обычно вслед за HBsAg в конце инкубационного периода или на ранней стадии заболевания. Появление в сыворотке HBeAg свидетельствует об остром, а выявление этого антигена в течение длительного времени — о хроническом гепатите, вызванном вирусом гепатита B. После исчезновения HBeAg в сыворотке появляются антитела к нему. Присутствие этих антител в сыворотке свидетельствует о выздоровлении, а при длительном выявлении HBsAg — о носительстве вируса гепатита B. Риск заражения от больного, в сыворотке которого одновременно выявляются HBsAg и HBeAg, в 10 раз выше, чем от больного, в сыворотке которого одновременно выявляются HBsAg и антитела к HBeAg, а HBeAg отсутствует. Выявление в сыворотке больного и HBsAg, и HBeAg свидетельствует о высоком риске заражения при контакте с этим больным. Комплексное определение антигенов вируса гепатита B и антител к ним позволяет поставить диагноз, определить стадию заболевания, оценить риск заражения и иммунный ответ.

3. Вирус гепатита C относится к РНК-содержащим вирусам. Заражение вирусом гепатита C — основная причина посттрансфузионного гепатита ни-A ни-B (70—90%). С 1990 г. стало возможным определение антител к вирусу гепатита C. Их обычно удается выявить не ранее чем через 3 мес после начала заболевания, когда начинает снижаться активность АсАТ и АлАТ. Поскольку антитела к вирусу гепатита C не выполняют защитную функцию, их появление не отражает развития иммунитета. Следует еще раз подчеркнуть, что отсутствие антител к вирусу гепатита C не исключает заболевания.

4. Вирус гепатита D состоит из дефектной РНК и HDAg, окруженных внешней оболочкой, содержащей HBsAg. Вирус гепатита D реплицируется только в присутствии вируса гепатита B и обнаруживается главным образом у наркоманов, гомосексуалистов и больных гемофилией. Этот вирус чаще, чем другие возбудители вирусного гепатита, бывает причиной молниеносного гепатита и цирроза печени. Серодиагностика гепатита D основана на применении антител к HDAg. Гепатит D исключают при рецидиве желтухи после перенесенного гепатита B.

5. Вирус гепатита E. Механизм передачи фекально-оральный. Во многих странах наблюдаются вспышки гепатита E, вызванного употреблением зараженной воды. Наборы для выявления антител к вирусу гепатита E можно приобрести в Центре по контролю заболеваемости.

Ж. ВИЧ. Для диагностики ВИЧ-инфекции используется твердофазный ИФА и иммуноблоттинг (см. гл. 19, п. I.Г.1).