XIV. Определение группы крови и Rh-фактора.
Следует учитывать, что эритроциты содержат групповые антигены (агглютиногены) А, В или оба, а в сыворотке крови имеются групповые антитела (агглютинины) a и b.
Реактивы и оборудование: стандартные сыворотки группы 0(I), А(II), В(III), АВ(IV), стандартные эритроциты группы А(II) и В(III), физиологический раствор хлорида натрия (0,9% раствор NaCl), предметные стекла и белые тарелки (или специальные планшеты), скарификатор, глазные пипетки, вата, спирт, настойка йода, песочные часы на 5 мин, карандаш по стеклу.
При определении группы крови простой реакцией используют две серии стандартных гемагглютинирующих сывороток с титром не ниже 1:32.
На левой стороне тарелки или планшета надписывают 0(I), в средине А(II), на правой стороне В(III), обязательно отмечают фамилию больного. Наносят 2-3 капли изогемагглютинирующих сывороток соответственно сделанным отметкам. В каждую каплю сыворотки добавляют в 5-10 раз меньшее количество исследуемой крови. Капли тщательно смешивают. Результат реакции учитывают через 5 мин. Если агглютинация появилась нечеткая, к смеси сыворотки и крови добавляют по одной капле физиологического раствора.
Оценка результатов следующая:
а) если во всех трех каплях агглютинации нет, кровь не содержит антигенов А и В, т.е. относится к группе О (I);
б) появление агглютинации в каплях с сыворотками первой группы, содержащей изогемагглютинины αВ и третьей группы (изогемагглютинин α) указывает на наличие антигена А, следовательно кровь относится к группе А(II);
в) агглютинация в каплях с сыворотками первой и второй группы указывает на наличие в крови антигена В и кровь относится к группе В(III);
г) если агглютинация наступила во всех трех группах, кровь содержит антигены А и В, т.е. относится к группе АВ (IV), в подобном случае надо исключить неспецифическую агглютинацию. Для этого таким же способом исследуют поведение испытуемой крови со стандартной сывороткой к группе АВ(IV). Если агглютинация не наступила, подтверждается группа АВ (IV). Если агглютинация неспецифичная, она появляется и в этой пробе (табл. 14.1)
Таблица 14.1.
Реакция агглютинации при определении групп крови методом стандартных сывороток.
| Агглютинины сыворотки | Антигены эритроцитов | |||
| 0(І) | А(ІІ) | В(ІІІ) | АВ(ІV) | |
| αβ(I) | - | + | + | + |
| β(II) | - | - | + | + |
| α(III) | - | + | - | + |
| 0(IV) | - | - | - | - |
При определении группы крови двойной реакцией помимо стандартных сывороток необходимы и стандартные эритроциты. Последние представляют собой 10-20% взвесь эритроцитов группы А(ІІ) и В(ІІІ) в цитратно-физиологическом растворе. Хранятся в холодильнике 2-3дня.
Для определения группы крови по стандартным эритроцитам на тарелку (планшет) наносят 2 капли отстоявшейся сыворотки. В первую добавляют одну каплю стандартных эритроцитов А(ІІ), во вторую – В(ІІІ), капли перемешивают и учитывают реакцию через 5 минут:
1. агглютинация с эритроцитами А(ІІ) и В(ІІІ) указывает на то, что исследуемая сыворотка принадлежит к 0(І) группе крови – в ней содержатся агглютинины α и β;
2. отсутствие агглютинации с эритроцитами А(ІІ) и В(ІІІ) указывает на принадлежность исследуемой сыворотки к группе АВ(IV) – в ней отсутствуют агглютинины;
3. агглютинация с эритроцитами В(ІІІ) указывает на принадлежность исследуемой сыворотки к группе А(ІІ) – в ней присутствуют агглютинины β.
4. агглютинация с эритроцитами А(ІІ) указывает на принадлежность исследуемой сыворотки к группе В(ІІІ) – в ней присутствуют агглютинины α.
Рекомендуется определять группу крови на одной тарелке по стандартным сывороткам и стандартным эритроцитам одновременно.
Трудности при определении групп крови обычно связаны с:
1. неаккуратным обращением с пипетками;
2. низким титром стандартных сывороток;
3. неправильным соотношением сыворотки и крови;
4. засыханием капли после длительного стояния;
5. в редких случаях появляется панагглютинация – в этом и других сомнительных случаях кровь отправляют в специализированную лабораторию.
Кровь для определения резус-фактора берут в обычную пробирку в объёме 4-5 мл без стабилизатора. После образования сгустка пробирку встряхивают для увеличения количества отделившихся эритроцитов. Готовят 5-10% взвесь эритроцитов в собственной сыворотке. На чашку Петри в 6 точек наносят по 3 капли антирезусной сыворотки двух серий. К первой капле каждой серии добавляют 1 каплю взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле – контрольные резус-положительные и к 3 капле – контрольные резус-отрицательные эритроциты. Капли перемешивают и чашку Петри помещают в водяную баню на 10 минут при 45-47°С. Эритроциты, давшие агглютинацию с антирезусной сывороткой, являются резус-положительными.
Ошибки при определении резус-принадлежности: недоучёт групповой принадлежности крови и титра сыворотки антирезус, неправильное соотношение компонентов, неправильная температура бани, недостаточное время учёта (10 минут), использование просроченных сывороток.
В последние годы для определения групп крови и резус-принадлежности всё шире используются моноклональные тест-реагенты анти-А, анти-В и анти-D. Действующим элементом этих тест-систем являются специфические моноклональные IgM антитела к соответствующим антигенам эритроцитов человека, которые вызывают агглютинацию эритроцитов. Тест-реагенты анти-А и анти-В вызывают прямую агглютинацию эритроцитов, которые имеют группоспецифические антигены (по системе АВ0) соответственно А и В. Тест-реагенты не содержат антител другой специфичности и, поэтому, не вызывают неспецифической полиагглютинации эритроцитов. Они не являются продуктами клеток человека, поэтому исключена контаминация препаратов вирусами гепатита и СПИДа. Моноклональные тест-системы являются надёжными, реакция происходит быстрей и выразительней, по сравнению со стандартными сыворотками.
Для определения группы крови на тарелку (планшет) наносят по 1 капле (приблизительно 0,1 мл) тест-реагентов анти-А и анти-В. Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле (приблизительно 0,01 мл) исследуемой крови (или эритроцитов). Антитела и кровь смешивают тщательно сухой стеклянной палочкой. Наблюдают за ходом реакции при лёгком помешивании планшета в течение 3 минут (табл. 14.2)
Таблица 14.2.
Реакция агглютинации при определении групп крови методом моноклональных тест-систем
| Исследуемая кровь принадлежит к группе | ||
| анти-А | анти-В | |
| - | - | 0(І) |
| + | - | А(ІІ) |
| - | + | В(ІІІ) |
| + | + | АВ(IV) |
Тест-реагенты анти-D предназначены для определения резус-принадлежности крови человека путём определения на эритроцитах человека с помощью реакции прямой гемагглютинации D-антигена.
Для определения резус-принадлежности на планшет наносится капля (приблизительно 0,1 мл) тест-реагента анти-D. Рядом помещают маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови и смешивают стеклянной палочкой с тест-реагентом. Реакция агглютинации начинает развиваться через 30 секунд при слабом пошатывании планшета, чётко выраженная агглютинация наступает через 60 секунд. Однако учёт результатов реакции следует проводить через 5 минут, т.к. с эритроцитами, которые несут слабый D-антиген, реакция развивается медленней.
В случае отрицательной реакции у доноров следует проверить кровь в реакции с желатином тем самым тест-антигеном. Для этого в пробирку вносят одну каплю (0,1 мл) суспензии исследуемых эритроцитов. Затем добавляют 2 капли (0,2 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого при 45-50°С до растворения и одну каплю (0,1 мл) тест-реагента анти-D. Смесь тщательно перемешивают, инкубируют 10 минут на водяной бане или 30 минут в термостате при 48 °С, добавляют физиологический раствор до бледно-розового окрашивания раствора. Наличие агглютинации определяют визуально после аккуратного поворачивания пробирки. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о наличии в них D-антигена.