А Программа
1. Возможности методов серодиагностики при оценке гуморального иммунного ответа.
2. Методы выявления иммунных комплексов.
3. Кожно-аллергические пробы для оценки клеточного
иммунитета и реакции гиперчувствительности замедленного типа.
4. Методы выявления специфической сенсибилизации Т-лимфоцитов.
5. Получение и применение вакцин, анатоксинов.
6. Получение и применение иммунных сывороток и иммуноглобулинов.
▲ Демонстрация
1.Результаты теста торможения миграции лейкоцитов крови в присутствии причинного антигена.
2. Набор ампулированных препаратов инфекционных аллергенов, вакцин, сывороток, иммуноглобулинов, диагностикумов.
▲ Задание студентам
1. Протоколировать и оценить результаты развернутых реакций агглютинации, поставленных с парными сыворотками крови человека, иммунизированного бактериальной вакциной. Оценить эффективность вакцинации.
2. Протоколировать и оценить результаты РСК, поставленных с парными сыворотками крови человека, иммунизированного вирусной вакциной. Оценить эффективность вакцинации.
3. Протоколировать и оценить результаты РСК, поставленной с сывороткой крови больного с бактериальной инфекцией для дифференциации первичной инфекции и рецидива.
лМетодические указания
1. Реакция торможения миграции лейкоцитов. Воснове дан
ного метода лежит способность лимфоцитов после повтор
ного контакта с антигеном, к которому они были ранее
сенсибилизированы, продуцировать различные лимфоки-
н ы, в том числе влияющие на миграцию индикаторных кле
ток (гранулоциты, моноциты, макрофаги). Реакция торможе
ния миграции лейкоцитов (РТМЛ) периферической крови в
присутствии причинного антигена позволяет выявить специ
фическую сенсибилизацию Т-лимфоцитов. РТМЛ ставят в ка
пиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейко
цитов крови в присутствии и в отсутствие причинного мик
робного антигена, после чего измеряют зоны миграции (в про
центах) в присутствии антигена по сравнению с контролем,
принятым за 100 %.
В случае выявления сенсибилизации к антигену наблюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже
2. Постановка и оценка кожно-аллергической пробы.Для вы
явления специфической сенсибилизации (при туберкулезе,
бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях) ставят кожно-аллергические пробы. Например, при постановке пробы Манту внутрикожно вводят раствор туберкулина определенной концентрации. Реакцию учитывают через 24—48 ч, оценивая степень выраженности гиперемии и инфильтрат вокруг места введения (рис. 10.4.1; на вклейке). В основе положительной кожной пробы лежит клеточная реакция гиперчувствительности замедленного типа, которая отражает специфическую сенсибилизацию организма к данному инфекционному аллергену. Она возникает в результате текущего, перенесенного заболевания, вакцинации или инфицирования организма.
3. Выявление нарастания титра антител в серологических реакциях с парными сыворотками больного или вакцинированного.Показателем развития гуморального иммунного ответа является нарастание титра специфических антител в сыворотке крови в течение 3—4 нед после инфицирования или вакцинирования. Это устанавливается в реакции с парными сыворотками, т.е. сыворотками, полученными от одного и того же человека в динамике инфекционного или вакцинального процесса (например, на 1-й и 3—4-й неделе). Появление антител в сыворотке человека, у которого ранее этих антител не было, называется сероконверсией. Диагностическое значение придается, как правило, 4-кратному и более увеличению титра антител.
При бактериальных инфекциях или вакцинации бактериальными вакцинами с парными сыворотками ставят реакции агглютинации, РИГА или РСК (табл. 10.4.1).
Таблица 10.4.1. Результаты развернутой реакции агглютинации с бактериальным диагностикумом ипарными сыворотками человека, вакцинированного бактериальной вакциной
| Сроки взятия | Разведения сыворотки | Контроль сыворотки | Контроль диагноста-кума | ||||
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | |||
| До вакцинации Через 3 нед после вакцинации | +++ — — — — +++ +++++— — | — | |||||
Таблица 10.4.2. Результаты РСК с диагностикумом вируса гриппа (эпидемический штамм) и парными сыворотками человека, обследованного в период эпидемии гриппа
| Сроки взятия крови |
| Контроль сыворотки |
| Контроль диа-гности-кума |
Разведения сыворотки
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160
В самом начале + + — — — — —
эпидемии
Через месяц после + + + + — — —
начала эпидемии
4. Постановка РСКс целью дифференцирования IgM и IgG.
Серологические реакции могут быть использованы для ориентировочного определения принадлежности специфических антител к одному из двух основных изотипов иммуноглобулинов IgM или IgG. Возможность дифференцировать эти два изотипа иммуноглобулинов основана на их различной чувствительности к действию 2-меркаптоэтанола, цистеина и других редуцирующих веществ, которые вызывают разрывы дисульфитных связей в молекулах IgM и их распад на субъединицы, лишенные антительной активности. Под действием той же концентрации 2-меркаптоэтанола молекулы IgG сохраняют свою целостность и антительную активность. Исходя из этого ставят серологическую реакцию (РСК или РТГА) с испытуемой сывороткой: нативной и обработанной 2-меркаптоэтанолом (табл. 10.4.3).
Таблица 10.4.3. Результаты РСК с сывороткой больного, обработанной 2-меркаптоэтанолом (2МЕ), для определения принадлежности антител к IgG или IgM изотипу иммуноглобулинов
| Исследуе- | Разведения сыворотки | ||||||||
| ротка | 1:100 | 1:200 | 1:300 | 1:400 | 1:500 | 1:600 | 1:700 | 1:800 | 1:1000 |
| После обработки 2МЕ Без обработки 2МЕ | + + | + + | + + + + + + | + | + | ||||
При вирусных инфекциях или вакцинации вирусными вакцинами с парными сыворотками ставят РСК, PTIA и реакцию нейтрализации вирусов (табл. 10.4.2).
Нарастание титра антитоксических антител контролируют с помощью реакции флоккуляции или нейтрализации токсина.
При первичной инфекции гуморальный ответ начинается с синтеза IgM, а при рецидиве инфекции на повторную встречу с тем же антигеном иммунная система отвечает преимущественным синтезом IgG.
Снижение титра специфических антител в исследуемой сы-
воротке в результате обработки 2-меркаптоэтанолом свидетельствует в пользу первичной инфекции.
Для определения принадлежности специфических антител к определенному классу (изотипу) иммуноглобулинов используют также твердофазный иммуноферментный метод. Специфический антиген фиксируется на поверхности лунок планшетов из полистирола и инкубируется с исследуемой сывороткой. После отмывания от несвязанных иммобилизованным антигеном белков сыворотки связанные антитела-иммуноглобулины идентифицируются с помощью антиизотипической антиглобу-линовой сыворотки или соответствующих МКАТ. Их связывание в свою очередь устанавливается с помощью антииммуно-глобулиновой сыворотки с ковалентно прикрепленным ферментом.