МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ

Введение.Все микробиологические, биохимические и моле-кулярно-биологические исследования микроорганизмов про­водят в специальных лабораториях, структура и оборудование которых зависят от объектов исследования (бактерий, вирусов, грибов, простейших), а также от их целевой направленности (научные исследования, диагностика заболеваний). Изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и животных осуществляют в иммунологических и серологичес­ких (serum — сыворотка крови) лабораториях.

Бактериологические, вирусологические, микологические и серологические (иммунологические) лаборатории входят в со­став санитарно-эпидемиологических станций (СЭС), диагнос­тических центров и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняют бактериологические, вирусологические и серологи­ческие анализы материалов, полученных от больных и контак­тировавших с ними лиц, обследуют бактерионосителей и про­водят санитарно-микробиологические исследования воды, воз­духа, почвы, пищевых продуктов и т.д.

В бактериологических и серологических лабораториях боль­ниц и диагностических центров проводят исследования с целью диагностики кишечных, гнойных, респираторных и дру­гих инфекционных заболеваний, осуществляют микробиологи­ческий контроль за стерилизацией и дезинфекцией.

Диагностику особо опасных инфекций (чума, туляремия, сибирская язва и др.) проводят в специальных режимных ла­бораториях, организация и порядок деятельности которых строго регламентированы.

В вирусологических лабораториях диагностируют заболева­ния, вызванные вирусами (грипп, гепатит, полиомиелит и др.), некоторыми бактериями — хламидиями (орнитоз и др.) и рик-кетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.). При организации и оборудовании вирусологических лабораторий учитывают спе­цифику работы с вирусами, культурами клеток и куриными эмбрионами, требующую строжайшей асептики.

В микологических лабораториях проводят диагностику за­болеваний, вызываемых патогенными грибами, возбудителями микозов.

Лаборатории обычно размещаются в нескольких помещени­ях, площадь которых определяется объемом работ и целевым назначением. В каждой лаборатории предусмотрены:

а) боксы для работы с отдельными группами возбудителей;

б) помещения для серологических исследований;

в) помещения для мойки и стерилизации посуды, приготов­
ления питательных сред;

г) виварий с боксами для здоровых и подопытных живот­
ных;

д) регистратура для приема и выдачи анализов.

Наряду с этими помещениями в вирусологических лабора­ториях имеются боксы для специальной обработки исследуе­мого материала и работы с культурами клеток.

Оборудование микробиологических лабораторий.Лаборатории снабжены рядом обязательных приборов и аппаратов.

1. Приборы для микроскопии: биологический иммерсион­ный микроскоп с дополнительными приспособлениями (ос­ветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный кон­денсор и др.), люминесцентный микроскоп.

2. Термостаты и холодильники.

3. Приборы для приготовления питательных сред, растворов и т.д.: аппарат для получения дистиллированной воды (дистил­лятор), технические и аналитические весы, рН-метры, аппара­тура для фильтрования, водяные бани, центрифуги.

4. Набор инструментов для манипуляций с микробами: бак­териологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.

5. Лабораторная посуда: пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки и др., аппарат для изготовления ватно-марлевых про­бок.

Крупные диагностические комплексы имеют автоматичес­кие анализаторы и компьютеризированную систему оценки полученной информации.

В лаборатории выделено место для окраски микроскопичес­ких препаратов, где находятся растворы специальных красите­лей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и емкостью с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми пита­тельными средами, химическими реактивами, диагностически­ми препаратами и другими материалами.

В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки се­рологических реакций. Для выращивания, хранения культур,

стерилизации лабораторной посуды и других целей используют следующую аппаратуру.

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоян­ная температура. Оптимальная температура для размножения большинства патогенных микроорганизмов 37 "С. Термостаты бывают воздушными и водяными.

2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорга­низмов в анаэробных условиях.

3. С0₂ -инкубатор. Аппарат для создания постоянной тем­пературы и атмосферы определенного газового состава. Пред­назначен для культивирования микроорганизмов, требователь­ных к газовому составу атмосферы.

4. Холодильники. Используют в микробиологических лабора­ториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически актив­ных препаратов при температуре около 4 °С. Для хранения препаратов при температуре ниже О °С применяют низкотем­пературные холодильники, в которых поддерживается темпе­ратура —20 °С или —75 "С.

5. Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганиз­мов, эритроцитов и других клеток, для разделения неоднород­ных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях исполь­зуют центрифуги с различными режимами работы.

6. Сушилъно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Пред­назначен для суховоздушной стерилизации стеклянной лабо­раторной посуды и других жаростойких материалов.

7. Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для сте­рилизации перегретым водяным паром (под давлением). В ми­кробиологических лабораториях используют автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, пере­носные).

Тема 1.1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ, МИКОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. УСТРОЙСТВО СОВРЕМЕННЫХ МИКРОСКОПОВ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

▲ План

▲ Программа

 

1. Правила работы и организация микробиологических (бактериологических, вирусологических, микологи­ческих) лабораторий.

2. Основные приборы и оборудование микробиологичес­кой лаборатории.

3. Микроскопы и микроскопическая техника. Правила работы с иммерсионным микроскопом (объективами).

▲ Демонстрация

1. Устройство и применение основных приборов и обо­рудования, используемого в микробиологических ла­бораториях: термостата, центрифуг, автоклава, су­шильного шкафа, инструментария и посуды.

2. Устройство биологического микроскопа. Различные ме­тоды микроскопии: темнопольная, фазово-контраст-ная, люминесцентная, электронная.

3. Препараты микробов (дрожжей и бактерий) при раз­личных методах микроскопии.

А Задание студентам

1. Микроскопировать и зарисовать препараты дрожже-подобных грибов рода Candida, используя различные виды микроскопии.

▲ Методические указания

Правила работы в микробиологических лабораториях. Работу в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводят с возбудителями инфекционных заболеваний — пато­генными микроорганизмами. Поэтому для предохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать правила внутрен­него распорядка.

1. Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых слу­чаях работающие надевают на лицо маску из марли. Ра­бота с особо опасными микробами регламентируется спе­циальной инструкцией и проводится в режимных лабора­ториях.

2. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

3. Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.

4. При случайном попадании инфицированного мате­риала на стол, пол и другие поверхности это место необ­ходимо тщательно обработать дезинфицирующим раство­ром.

5. Хранение, наблюдение за культурами микробов и их уничтожение должны производиться согласно специаль­ной инструкции. Культуры патогенных микробов реги­стрируют в специальном журнале.

6. По окончании работы руки следует тщательно вы­мыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

▲ Микроскопы и методы микроскопии

Для микробиологических исследований используют не­сколько типов микроскопов (биологический, люминесцент-

Рис. 1.1. Микроскопы.

а — общий вид микроскопа "Биолам"; б — микроскоп МБР-1: 1 — основание микроскопа; 2 — предметный столик; 3 — винты для перемещения предмет­ного столика; 4 — клеммы, прижимающие препарат; 5 — конденсор; 6 — кронштейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий конденсор в гильзе; 8 — рукоятка перемещения конденсора; 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы кон­денсора; 10 — зеркало; 11 — тубусодержатель; 12 — рукоятка макрометричес-кого винта; 13 — рукоятка микрометрического винта; 14 — револьвер объек­тивов; 15 — объективы; 16 — наклонный тубус; 17 — винт для крепления ту­буса; 18 — окуляр.

ный, электронный) и специальные методы микроскопии (фа-зово-контрастный, темнопольный).

В микробиологической практике применяют микроскопы отечественных марок: МБР-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, "Био­лам" Р-1 и др. (рис. 1.1). Они предназначены для изучения формы, структуры, размеров и других признаков различных микробов, величина которых не менее 0,2—0,3 мкм.

Иммерсионная микроскопия.Применяется для увеличения разрешающей способности метода световой микроскопии. Раз­решающая способность системы светооптической микроско­пии определяется длиной волны видимого света и числовой апертурой системы. Числовая апертура показывает величину угла максимального конуса света, попадающего в объектив, и зависит от оптических свойств (преломляющей способности) среды между объектом и линзой объектива. Погружение объ­ектива в среду (минеральное масло, вода), имеющую высокий коэффициент преломления, близкий к таковому стекла, пре­пятствует рассеянию света от объекта. Таким образом дости-

Рис. 1.2. Ход лучей в иммерсионной системе, п — показатель преломления.

Рис. 1.3. Ход лучей в темнопольных конденсорах, а — параболоид-конденсор; б — кардиоид-конденсор; 1 — объектив; 2 — иммерсионное масло; 3 — препарат; 4 — зеркальная поверхность; 5 — диа­фрагма.

гается увеличение числовой апертуры и соответственно разре­шающей способности. Для иммерсионной микроскопии при­меняют специальные иммерсионные объективы, снабженные меткой (МИ — масляная иммерсия, ВИ — водная иммерсия). Предельная разрешающая способность иммерсионного микро­скопа не превышает 0,2 мкм. Ход лучей в иммерсионной системе показан на рис. 1.2.

Общее увеличение микроскопа определяется произведением

 

увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, уве­личение микроскопа с иммерсионным объективом 90 и окуля­ром 10 составляет: 90x10=900.

Микроскопия в проходящем свете (светлопольная микроско­пия).Используется для изучения окрашенных объектов в фик­сированных препаратах.

Темнопольная микроскопия.Применяется для прижизненно­го изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе (рис. 1.3). При этом способе освещения в объектив попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светя­щиеся частицы. Препарат в этом случае имеет вид, показанный на рис. 1.4, б (на вклейке).

Фазово-контрастная микроскопия.Предназначена для изуче­ния нативных препаратов. Фазово-контрастное приспособле­ние дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объек­ты. Свет проходит через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы световой волны, не воспринимаемое глазом. Фазовое устройство, вклю­чающее особые конденсор и объектив, обеспечивает преобра­зование изменений фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким образом достигается усиление различия в оптической плотности объектов. Они приобретают высокую контрастность, которая может быть позитивной или негатив­ной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изо­бражение объекта в светлом поле зрения, негативным — свет­лое изображение объекта на темном фоне (см. рис. 1.4; на вклейке).

Для фазово-контрастной микроскопии используют обыч­ный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устрой­ство КФ-1 или КФ-4 (рис. 1.5), а также специальные освети­тели.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия.Осно­вана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее под воздействием внешнего излучения: светового, ультрафиолето­вого, ионизирующего и др. Фотолюминесценция — люмине­сценция объекта под влиянием света. Если освещать люминес-цирующий объект синим светом, то он испускает лучи крас­ного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Длина волны излуча-

Рис. 1.5. Фазово-контрастное устройство, а — фазовые объективы; б — вспомогательный микроскоп; в — фазовый кон­денсор.

емого света (цвет люминесценции) зависит от физико-хими­ческой структуры люминесцирующего вещества.

Первичная люминесценция биологических объектов (собст­венная, или биолюминесценция) наблюдается без предвари­тельного окрашивания за счет наличия собственных люминес-цирующих веществ, вторичная (наведенная) — возникает в ре­зультате окрашивания препаратов специальными люминесци-рующими красителями — флюорохромами (акридиновый оран­жевый, ауромин, корифосфин и др.). Люминесцентная микро­скопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследовать живые микробы и обнаруживать их в исследуемом материале в небольших кон­центрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике люминесцентную микроскопию широко применяют для выявления и изучения многих микро­бов.

Электронная микроскопия.Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способнос­ти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяют для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других суб­микроскопических объектов. Световые лучи в таких микроско­пах заменяет поток электронов, имеющий при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм, т.е. почти в 100 000 раз меньше длины волны видимого света. Высокая разре­шающая способность электронного микроскопа, достигаю­щая 0,1—0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличе­ние до 1 000 000.

 

Наряду с приборами "просвечивающего" типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рель­ефное изображение поверхности объекта. Разрешающая спо­собность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов "просвечивающего" типа.

Правила работы с микроскопом.Работа с любым световым микроскопом включает установку правильного освещения по­ля зрения и препарата и его микроскопию различными объек­тивами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным, для чего используют специальные источники света — осветители разных марок.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка:

1) на приготовленный на предметном стекле и окрашенный
мазок нанести каплю иммерсионного масла и поместить его
на предметный столик, укрепив зажимами;

2) повернуть револьвер до отметки иммерсионного объек­тива 90х или ЮОх;

3) осторожно опустить тубус микроскопа до погружения

объектива в каплю масла;

4) установить ориентировочный фокус при помощи макро-

метрического винта;

5) провести окончательную фокусировку препарата микро­
метрическим винтом, вращая его в пределах только одного
оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с пре­
паратом, так как это может повлечь поломку покровного стек­
ла или фронтальной линзы объектива (свободное расстояние
иммерсионного объектива 0,1—1 мм).

По окончании работы микроскопа необходимо удалить мас­ло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый

объектив 8х.

Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии ис­пользуют нативные препараты ("раздавленная" капля и др., см. тему 2.1); микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать 1 — 1,5 мм, покров­ных — 0,15—0,2 мм.