Внутриклеточная регистрация шума ионных каналов

В начале 1970-х годов, используя нервно-мышечный синапс лягушки, Катц и Миле­ди предприняли оригинальные эксперимен­ты, в которых метод внутриклеточной микро­электродной регистрации использовался для изучения характеристик «шумов», продуциру­емых медиатором ацетилхолином (АХ). В та­ком синапсе АХ, освобождающийся из мотор­ного нервного окончания, открывает хемовоз-будимые ионные каналы постсинаптической мембраны. Вход катионов в волокно через от­крытые ионные каналы вызывает деполяриза­цию мембраны (глава 9). Когда Катц и Миле­ди локально апплицировали экзогенный АХ на область синапса, они обнаружили, что вы­званная деполяризация сопровождалась элек­трическим «шумом». Во время стабильной де­поляризации быстрые колебания потенциала были гораздо больше колебаний изолинии в покое. Они предположили, что возраста­ние электрического шума в присутствии АХ было связано с хаотичным открытием и за­крытием АХ-активируемых ионных каналов. Иными словами, аппликация АХ приводила к открытию большого числа ионных каналов, и число это случайно колебалось в зависи­мости от числа взаимодействий АХ с рецеп­торами.

Используя известную из физики технику анализа шума, Катц н Миледи смогли по­лучить информацию о среднестатистическом поведении отдельного ионного канала, ак­тивируемого АХ. Позднее подобные экспе­рименты были проведены на том же объек­те Anderson и Stevens³). В отличие от пред­шественников, эти исследователи измеряли мембранный ток, вызванный АХ, что позво­лило установить величину и продолжитель­ность ионных токов через одиночный канал (рис. 2.5В).

Принципы анализа шума достаточно про­сты: во-первых, если токи одиночного кана­ла являются большими, суммарный шум так­же будет большим. Во-вторых, ионные кана­лы, открывающиеся на относительно длитель­ное время, будут продуцировать низкочастот­ный шум; наоборот, каналы, открывающие­ся на короткое время, будут продуцировать высокочастотный шум. Исследование ампли­тудно-временных характеристик шумов, ак-

Раздел II. Передача информации в нервной системе

Рис.2.5. Внутриклеточное отведение электри­ческого «шума», производимого функциониро­ванием ионных каналов. (А) Схема установ­ки для регистрации мембранного потенциала. (В) Внутриклеточная регистрация эффекта аце-тилхолина. (С) При большем усилении виден ацегилхолиноеый «шум». Fig.2.5. Intracel ular Recording of Channel Noise. (A) Arrangement for recording membrane potentials of muscle fibers with a microelectrode. The electrode is connected to a preamplifier, and the signals are displayed on an oscilloscope or computer screen. Penetration of the electrode in­to a fiber is marked by the sudden appearance of the resting potential (downward deflection on the screen). After penetration, changes in potential due to channel activation can be measured. (B) Intracellular records of the effect of acetylcholine (ACh). In this experiment additional circuitry was used to record membrane current (rather than membrane potential). At rest (upper trace), there is no current across the membrane; application of ACh produces about 130 nA of inward current (lower trace). (C) Traces in В shown at greater amplification. The baseline shows little fluctua­tion at rest; the inward current produced by ACh shows relatively large fluctuations ("noise"), due to random opening and closing of ACh-activated channels. Analysis of the increased noise yields values for the single-channel current and the mean open time of the channels. (B and С after Anderson and Stevens, 1973.)

Preamplifier

(A) Mlcroelectrode

 

 

 

 

			В
Muscle chamber B)		Oscilloscope Rest
1S -100	-	ACh I
<-> -200	-	1 1 1 1 |

0 0.1 0.2 0 3 04 0.5 0.6

(С)

Rest

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Time (s)

Проводимость каналов Кинетическое поведение канала, то есть вре­мя его нахождения в закрытом и открытом со­стояниях, может предоставить информацию о механизмах открытия и закрытия канала, а также о константах скоростей этих процес­сов. С другой стороны, величина тока, прохо­дящего через ионный канал, является прямым отражением того, как быстро проникающие ионы движутся через канал. Ток ионов за­висит не только от свойств канала, но также от трансмембранного потенциала. Пример та­кого рода показан на рис. 2.6. На этом рисун­ке изображен фрагмент мембраны, который содержит один спонтанно активный ионный канал, проницаемый для калия. Растворы, как в пипетке, так и в ванночке для объ­екта, содержат одинаковую (150 ммоль) кон­центрацию ионов калия. Ионы калия через открытый канал могут двигаться в обоих на­правлениях. Однако поскольку концентрации ионов по обе стороны мембраны идентичны, а трансмембранный потенциал отсутствует, то нет никакого движения ионов ни в одном

тивированных АХ в нервно-мышечном сина­псе, показало, что через одиночный открытый ионный канал проходит около 10 миллионов ионов в секунду. Кроме того, выяснилось, что значение среднего открытого времени (т) ионного канала составляет от 1 до 2 мс.

Несмотря на широкое вытеснение пэтч-кламп методом, анализ шума до сих пор используется для изучения ионных каналов в клетках, которые не поддаются исследо­ванию с помощью пэтч-клампа, например, в некоторых областях центральной нервной системы⁸). Кроме того, анализ шума является сравнительно быстрым методом для получе­ния информации о свойствах большой попу­ляции каналов и используется в комбинации с пэтч-кламп регистрацией от целой клет­ки для идентификации типов каналов. Тем не менее, надо понимать, что с помощью ана­лиза шума невозможно получить детальную информацию о поведении одиночного кана­ла, особенно в каналах со сложной кинетикой или при наличии нескольких уровней прово­димости канала.

Глава 2. Ионные каналы и нейранальная сигнализация

 

 

 

(В)

Г Out

MV

-l^L In

- In

- Out

Рис.2.6. Влияние потенциала на ток

(С)

через одиночный калиевый канал

в симметричном растворе ионов калия

по обе стороны мембраны. (А) Схема

установки. (B-D) Примеры токов через

одиночные ионные каналы при разных о _₂

уровнях мембранного потенциала. (Е)

Ток через калиевый канал как функция

мембранного потенциала.

Fig.2.6. Effect of Potential on Currents ^(D) ? ²
through a single, spontaneously active 5

potassium channel in an outside-out g

patch, with 150 mM potassium in both ^ _,

(E)

the electrode and the bathing solu­
tion. (A) The recording system. The
output from the patch clamp amplifier
is proportional to the current across the
patch. The potential across the patch
is equal to the potential (VC) applied
to the input of the amplifier as shown.
Positive charge flowing out of the elec­
trode is defined as positive current. (B)
When no potential is applied to the
patch, no channel currents are seen be- <

cause there is no net flux of potassium

through the channels. (C) Application g,_

of +20 mV to the electrode results g-40

in an outward current (upward deflec­
tions) of about 2 pA through the chan- J
nels. (D) A -20 mV potential results
in inward channel currents (downward
deflections) of the same amplitude as
in С. (Е) Channel currents as a function
of applied voltage. The slope of the line
is the channel conductance (7). In this
case, 7 = 110 pS (picosiemens).

+20 mV

-20 mV

ггиппгыпгг

In