Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК

1. Инокулируют 30 мл среды LB (содержащей соответствующий антибиотик) 1/100 ее объема (300 мкл) ночной культуры, полученной из одной бактериальной колонии, содержащей интересующую плазмиду.

Выращивают бактериальную культуру при 37 С со встряхиванием (200 об/мин) до поздней логарифмической фазы (для достижения ОД600 ~ 0,6 необходимо 2-3 ч).

2. Инокулируют 500 мл нагретой до 37 С и содержащей соответствующий антибиотик среды LB, налитой в колбу на 2 л, 25 мл культуры, полученной на первом этапе. Инкубируют при 37 С при интенсивном встряхивании (200 об/мин) в течение 2,5 ч. ОД600 по окончании инкубации должно составлять ~ 1,0.

• Дополнительный этап: для выделения низкокопийных плазмид (типа pBR322) к культуре добавляют 2,5 мл хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле) до конечной концентрации в культуре 170 мкг/мл.

3. Растят культуру еще 12—16 ч (обычно в течение ночи) при 37 °С при интенсивном встряхивании (200 об/мин).

4. Собирают бактериальные клетки центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин (ротор Sorvall GSA или его аналог). Сливают супернатант, центрифужные стаканы переворачивают и дают супернатанту полностью стечь.

5. Ресуспендируют при встряхивании осадок бактериальных клеток в 10 мл содержащего лизоцим (2 мг/мл) буфера I и инкубируют их 10 мин во льду.

6. Добавляют 20 мл раствора II, закрывают центрифужный стакан и тщательно перемешивают его содержимое, несколько раз перевернув стакан. Инкубируют 5 мин во льду.

7. Добавляют 20 мл холодного раствора III, закрывают центрифужный стакан и тщательно перемешивают его содержимое встряхиванием. Инкубируют во льду от 10 до 20 мин. За это время должен образоваться рыхлый белый осадок, содержащий хромосомную ДНК, РНК и белково-мембранные комплексы.

8. Бактериальный лизат центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин при 4°С (ротор GS3 или его аналог).

 

9. Супернатант фильтруют через марлю в центрифужный стакан на 250 мл, добавляют 0,6 объема изопропанола, хорошо перемешивают и для образования осадка нуклеиновых кислот помещают на -20 С на 20 мин.

10. Осадок нуклеиновых кислот собирают центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин при 4 С (ротор Sorvall GS3 или его аналог).

11. Осторожно сливают супернатант, переворачивают пробирку и дают полностью стечь супернатанту (примерно 30 мин при комнатной температуре).

12. Растворяют осадок нуклеиновых кислот в 8,8 мл ТЭ.

13. К 8,8 мл ресуспендированного осадка добавляют сухой CsCI из расчета 1 г на 1 мл раствора ДНК, аккуратно перемешивают до растворения CsCl, добавляют 0,4 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл в воде),

14. С помощью пастеровской пипетки или одноразового шприца переносят красный прозрачный раствор в быстрозаплавляемую пробирку Beckman (или аналогичную) и заполняют ее доверху легким минеральным маслом. Заплавляют пробирку согласно указаниям фирмы-изготовителя и центрифугируют при 100 000 g в течение 40 ч при 20 С (например, в роторе Beckman 50Ti). Можно использовать угловые и вертикальные роторы других фирм (например, Beckman 70Ti; в этом случае центрифугирование проводят при 250 000 g в течение 16 ч). Пробирки должны быть уравновешены с точностью до 0,02 г.

15. Чтобы отобрать плазмидную ДНК, прокалывают верхнюю часть пробирки с помощью иглы для подкожных инъекций № 19, чтобы в пробирку вошел воздух. Затем вводят иглу № 21, надетую на шприц на 2 мл (скошенной стороной вверх), в нижнюю окрашенную в красный цвет зону, отбирают плазмидную ДНК и переносят ее в стерильную пробирку. Если количество плазмидной ДНК невелико, то для ее визуализации пробирку освещают длинноволновым УФ-светом.

16. Бромистый этидий экстрагируют с помощью насыщенного водой изобутилового спирта. Для этого к раствору плазмидной ДНК добавляют равный объем насыщенного изобутилового спирта, перемешивают и отбирают верхний слой. Операцию повторяют до тех пор, пока изобутиловый спирт не перестанет окрашиваться.

17. Для удаления из раствора ДНК CsCl добавляют равное количество воды и переосаждают ДНК двумя объемами этанола при 4 С в течение 15 мин. Плазмидную ДНК собирают центрифугированием при 10 000 g в течение 15 мин при 4 °С (ротор Sorvall SS34 или его аналог); осадок ДНК растворяют примерно в 1 мл ТЭ. Определяют ОД260 конечного раствора ДНК и рассчитывают его концентрацию. Разливают раствор ДНК на аликвоты и хранят при —20 °С.

- Состав этих растворов приведен в протоколе. - Состав этих растворов приведен в протоколе. - Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА.