Исследование стерильности лекарственных средств.

В соответствии с рекомендациями Международной федерации фармацевтов и Государственной Фармакопеи стерильными должны быть следующие лекарственные препараты:

• лекарственные средства для парентерального применения (инъекций, инфузий и др. способов введения);

• глазные лекарственные средства (капли, мази, пленки и др.);

• лекарственные средства для новорожденных;

• субстанции и вспомогательные вещества, используемые при получении стерильных лекарственных средств, которые не подвергаются стерилизации в процессе производства;

• лекарственные средства для введения в полость тела, где в нормальном состоянии отсутствует микрофлора.

При изготовлении инъекционных растворов необходимо соблюдать особые условия. В частности, инъекционные растворы перед стерилизацией должны содержать не более 30 микробных клеток в 1 мл, а время от момента их изготовления до стерилизации не должно превышать 17 часов. Предназначенная для изготовления стерильных лекарственных форм дистиллированная вода до стерилизации не должна содержать кишечной палочки, а общее количество микроорганизмов не должно превышать 10—15 клеток в 1 мл.

Стерильность лекарственных средств достигается совокупностью противомикробных мероприятий на всех этапах их изготовления, хранения и использования.

Для предупреждения первичной микробной контаминации при изготовлении лекарственных препаратов необходимо ограничить содержание микробов в сырье, обеспечить стерильность растворителей, разбавителей, создать асептические условия технологического процесса. В соответствии с принципами GMP (Good manufacturing practice — надлежащая произ­водственная практика) производство стерильной продукции осуществляется в специальных так называемых «чистых» помещениях, в воздухе которых регламентируется строго определенное количество аэрозольных частиц и микроорганизмов. С целью обеспечения выпуска продукции высокого качества необходимо строгое соблюдение персоналом санитарно-гигиенических правил.

Испытание на стерильностьпроводится в асептических условиях, в боксах, желательно под вытяжкой стерильного ламинарного потока воздуха, в стерильной антистатической одежде. Помещение бокса моют горячей водой с мылом и обрабатывают дезинфицирующи­ми растворами в определенной последовательности (например, 0,5% раствором цитазола, 5% раствором формалина, 3% раствором перекиси водорода с моющим порошком «Прогресс» или «Сульфонол»). За 2 ч до начала работы в боксе включают бактерицидные лампы для обеспложивания воздуха и поверхностей. Воздух в боксе должен регулярно проверяться на микробную загрязненность. Для этого чашки Петри с МПА и средой Сабуро оставляют открытыми на 15 мин, затем закрывают и выдерживают в термостате при 37⁰ С 48 ч. На чашке не должно быть более 5 колоний, большее их количество свидетельствует о высокой загрязненности бокса. Не должно быть в воздухе бокса плесневых и дрожжевых грибов. Работа в боксе производится в стерильных халатах и тапочках.

Стерильность готовых лекарственных средств, а также субстанций и вспомогательных веществ, используемых при их изготовлении, проверяется методом прямого посева или методом мембранной фильтрации с использованием жидкой тиогликолевой (меркаптоуксусной) среды для выделения бактерий и жидкой среды Сабуро для обнаружения грибов.

Определение стерильности лекарственных средств, субстанций, вспомогательных веществ методом прямого посева.Лекарственное средство в виде раствора вносят в стерильные колбы (пробирки) со средами в соотношении 1:10 , с учетом объема препарата. При объеме менее 1 мл высевают весь объем; 1-4 мл — 1 мл, 5-19 мл — 2 мл; 20-100 мл — 2-4 мл; более 100 мл — 10 мл.

Выполняются контроли на нейтрализацию возможного антимикробного действия либо введением соответствующего инактиватора, либо разведением препарата (см. вышеописанные способы устранения антимикробного действия). Дополнительно ставят контроль роста тест-штаммов без препарата путем добавления в среды по 0,1 мл взвеси суточных тест-штаммов S. aureus, E. coli, В. subtilis, С. albicans (посевная доза 1000 бактерий).

Посевы инкубируют 14 дней в тиогликолевой среде при температуре 37⁰ С, в среде Сабуро - при 24⁰ С. Лекарственное средство считается стерильным если после 14-дневного выращивания в опытных колбах (пробирках) нет признаков роста микроорганизмов (помутнение, пленка, осадок, другие макроскопические изменения), а в контрольных есть. При наличии признаков роста готовят мазок, окрашивают его по Граму, подтверждая при микроскопии наличие микроорганизмов в исследуемых образцах и свидетельствуя о нестерильности препарата.

При испытании на стерильность мазей или растворов лекарственных средств в маслах в колбу объемом 250 мл, содержащую стеклянные бусы, вносят асептически 0,1 г (мл) образца, 100 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 6,8-7,0 и эмульгатор твин- 80 в концентрации 2,5 % (в мази на водорастворимой основе эмульгатор не вно­сят). Содержимое колбы подогревают до 42⁰ С, встряхивают до получения однородной эмульсии, после чего 5 мл вносят в колбу с 40 мл тиогликолевой среды и 5 мл - в колбу с 40 мл среды Сабуро. Дальнейший ход исследования такой же, как при исследовании на стерильность растворов.

Определение стерильности инъекционных препаратов (на примере полиглюкина).До посева флаконы с препаратом инкубируют 3 суток при 37⁰ С для выявления спороносных форм микроорганизмов, переходящих в течение этого времени в вегетативные формы. Для определения стерильности полиглюкина берут 6 флаконов от каждой загрузки автоклава. Выполняют посевы (по 2 мл препарата) в 5 флаконов с 50 мл глюкозного МПА, на 4 пробирки со средой Китт-Тароцци, на 4 пробирки с жидкой средой Сабуро. Посевы инкубируют 8 суток в термостате: при 37⁰ С - 3 флакона МПБ с глюкозой, 4 пробирки со средой Кита-Тароцци; при 24⁰С - 2 флакона МПБ с глюкозой, 4 пробирки со средой Сабуро. Для контроля пригодности питательной среды один из флаконов с МПБ одновременно засевают 18-часовой культурой S. aureus штамм 209-Р, внося во флакон 1 каплю 1 млн взвеси, и выдерживают в термостате при 37°С в течение 8 сут. Отсутствие роста микроорганизмов в посевах указывает на стерильность полиглюкина. При проросте питательных сред опыт повторяют из удвоенного количества образцов на двойном количестве сред.

Определение стерильности антибиотиков. Содержимое флакона с препаратом растворяют в стерильной дистиллированной воде. Препарат высевают в 15 пробирок с МПБ и глюкозой, в 5 пробирок со средой Сабуро по 0,2 мл, создавая концентрацию антибиотика 2500 ЕД. 10 пробирок с МПБ выдерживают в термостате при температуре 37⁰ С, 5 пробирок с МПБ и 5 пробирок со средой Сабуро - при 24⁰ С в течение 5 суток. Для проверки инактивации антибиотика пробирку с МПБ засевают 18-часовой культурой тест-микроорганизма в дозе 250 микробных клеток на 1 мл среды с последующим выращиванием при 37⁰ С 5 суток. Эта пробирка должна быть мутной. При проросте питательной среды посевы повторяют на двойном количестве сред. При наличии одного пророста, препарат считается нестерильным.

Определение стерильности химико-фармацевтических препаратов, не обладающих бактериостатическим действием.

Препарат засевают по 0,5 мл в 5 пробирок сМПБ с глюкозой, по 0,2 мл в 3 пробирки с МПА, для выявления анаэробов - по 0,5 мл в 3 пробирки со средой Кита- Тароцци и для выявления плесневых и дрожжевых грибов - по 0,5 мл в 3 пробирки со средой Сабуро. Засеянные среды выдерживают в термостате: при 37°С - 3 пробирки глюкозого МПБ с, 3 пробирки с МПА, 3 пробирки со средой Китта-Тароцци; при 24⁰С -2 пробирки с глюкозным МПБ, 3 пробирки со средой Сабуро. Посевы выдерживают 7- сут при ежедневном просмотре. При проросте сред опыт повторяется из удвоенного количества образцов на двойном количестве сред.

Масляные препараты перед посевом эмульгируют в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия с бусами (в колбу помещают 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 2—3 бусинки). Препарат вносят стерильно в количестве 1 мл и встряхивают 3—5 мин, а затем высевают на питательные среды.

Определение стерильности препаратов, обладающих бактериостатическим действием. Препарат засевают по 5 мл в колбы с 200 мл глюкозного МПБ, инкубируют в течение 3 суток при 37⁰ С. Затем делают высевы также, как и при проверке стерильности препаратов, не обладающих бактериостатическим действием.

Определение стерильности препаратов, обладающих бактерицидным действием.

Используется метод мембранной фильтрации, более надежный и экономичный по сравнению с методом посевов. Раствор препарата пропускают через 2 мембранных фильтра, по 10 мл через каждый фильтр. После фильтрации фильтры отмывают от препарата тремя порциями стерильного изотонического раствора хлорида натрия по 100 мл. Фильтры помещают в чашки Петри для определения бактерий — на МПА или тиогликолевую среду, а для определения плесневых и дрожжевых грибов — на среду Сабуро. Наблюдение за посевом ведут в течение 7 сут. На фильтрах не должно вырасти никаких колоний микроорганизмов. В случае пророста опыт повторяют из удвоенного количества образцов и на двойном количестве сред.