Иммуноблот ИБ (вестернблот)

ИБ – метод, позволяющий одновременно выявлять специфические антитела к спектру антигенов (к каждому из них) в сыворотке или другом материале. ИБ основан на тИФА; в отличие от тИФА в планшетах обладает большей специфичностью (но меньшей чувствительностью).

Этапы постановки ИБ (рис. 11):

1. Подготовка антигенов:

· лизис/дезинтеграция вирусов, бактерий;

· обработка додецил сульфатом натрия (SDS) для придания всем компонентам схожего соотношения отрицательный заряд/молекулярная масса.

2. Получение блотов:

· разгонка антигенов в электрофорезе (пропорционально размеру);

· перенос антигенов на мембрану;

· разрезание мембраны на блоты (полоски, содержащие спектр антигенов) .

3. Проведение реакции:

· обработка блота сывороткой больного (специфические антитела больного связываются с соответствующими антигенами);

· выявление связавшихся антител антивидовыми антителами к иммуноглобулинам человека, меченными ферментом;

· внесение субстрата и проявление блотов (при связывании специфических антител в месте связывания образуется пятно);

· учет реакции (сравнение результата с положительным и отрицательным контролями) и выдача заключения.

ИБ применяют для:

· подтверждения результатов других серологических реакций;

· идентификации бактериальных или вирусных белков;

· идентификации микробов;

· научных целей.

 

Электрофорез Загрузка в гель Обработка SDS Дезинтеграция микробов
Антигены распределяются в геле в соответствии с молекулярной массой
	· Внесение сыворотки больного (специфические антитела связываются с соответствующими антигенами) · Добавление антител против иммуноглобулинов человека, меченных ферментом · Добавление субстрата и учет реакции

Рисунок 11. Схема проведения иммуноблоттинга