Розв’язання.

Препарат одноланцюгової ДНК розділяють на 4 частини, 5′ - кінець

 

дволанцюгової молекули ДНК помічений ³²Р.

 

 

 

1 2 3 4

 

Кожну частину обробляють хімічним реагентом, який специфічно руйнує ланцюг біля одної або двох основ. Після обробки піперидином на місцях пошкоджень виникають розриви. Наприклад, якщо G знаходиться в положеннях 3, 6, 9 в фрагменті з 10 основ утворяться уривки довжиною 3, 6, 9 нуклеотидів ( утворяться, відповідно, і уривки довжиною 2, 5, 8, але в них не буде радіоактивної мітки). Припустимо, що першу частину обробляють агентом, який руйнує G, другу – А або G, третю – Т або С, четверту – С. При кожній з чотирьох реакцій, що відбуваються паралельно, утворюються фрагменти різної довжини. Під час електрофорезу в гелі на сусідніх доріжках ці фрагменти мігрують зі швидкістю, яка залежить від їх довжини. Ті з фрагментів, що містять радіоактивну мітку, в процесі електрофорезу утворюють радіоавтографію.

 

 

					Послідовність
	G	AG	TC	C
Довші			▬		T
	▬	▬			G
	▬			A
		▬	▬	C
▬	▬			G
		▬	▬	C
		▬		T
▬	▬			G
	▬			A
Коротші			▬		T

 

 

Таким чином, по положенню відбитків можна визначити, яка з основ була зруйнована, та знайти нуклеотидну послідовність фрагменту ДНК:

5′ TAGTCGCAGT 3′

3′ ATCAGCGTCA 5′

 

 

2. Визначити нуклеотидну послідовність ланцюга за методом Сенгера,

5′ 3′

 

якщо одержано таку радіоавтографію:

 

	ddATP	ddTTP	ddCTP	ddGTP
	▬
	▬
	▬
		▬
			▬
			▬
			▬
▬
	▬
			▬

 

Препарат одноланцюгової ДНК розділяють на 4 частини, до кожної частини додають суміш:

 

Р³²

затравка

ДНК – полімераза

4 dNTP

+ 1ddNTP, для кожної

частини свій

 

При додаванні ДНК – полімерази починається нормальна полімеризація, яка починається із затравки, проте при включенні ланцюга 2′, 3′ - дидезоксинуклеотида реакція припиняється.

Як видно з формули, дидезоксинуклеотид (ddNTP)

 

 

 

не може утворювати фосфодіестерний зв’язок з наступним dNTP. Таким чином, утворюється набір ланцюгів різної довжини, в яких міститься радіоактивна мітка. Наприклад, при додаванні ddATP побудова допоміжного ланцюга переривається в місцях комплементарних нуклеотиду Т вихідного ланцюга.

При міграції в гелі утворені ланцюги розподіляються по довжині і утворюють радіоавтографії при перенесенні на плівку. Послідовність основ зчитується безпосередньо з плівки:

 

					Послідовність
ddATP	ddTTP	ddCTP	ddGTP
Довші	▬				A
	▬				A
	▬			T
		▬		C
			▬	G
			▬	G
			▬	G
▬				A
	▬			T
Коротші			▬		C

 

Для визначення послідовності вихідного фрагменту треба пам’ятати, що при читанні радіоавтографії визначається послідовність основ комплементарного ланцюжка.

 

5′ CTAGGGCTAA 3′

3′ TATCCCGATT 5′ – нуклеотидна послідовність

ланцюга, що аналізується