Методи клонування ДНК.

Клонування всього генома (на противагу клонуванню специфічних фрагментів) називають “шотган”— експериментами (shotgun experiment - метод дробовика). Для їх здійснення весь геном розділяють на фрагменти зручного розміру. Ці фрагменти вбудовують у клонуючий вектор з утворенням популяції химерних векторів. Набір таких клонованих фрагментів називають бібліотекою генома. Така бібліотека, одержана за допомогою фагового або плазмідного вектора (частіше - фагового, бо у ньому легше зберігати великі кількості химерних ДНК), може зберігатися необмежений термін і при появі нового зонду швидко може бути використана для пошуку специфічного фрагмента.

Клонування фрагментів, одержаних шляхом механічного дроблення пов’язане з рядом технічних труднощів: у вектор легше вбудувати рестрикт. Однак, складність такого вмонтовування є в тому, що сайти рестрикції можуть бути в невихідних місцях, наприклад, у середині гена, який потрібно клонувати. Один зі способів подолання цих проблем полягає у використанні більше ніж одної рестриктази, тобто у повторенні експеримента з різними ферментами, сайти пізнавання яких займають різні положення. Але це вимагає додаткового часу, і при роботі з довгою нуклеотидною послідовністю буває важко підібрати фермент, який не розрізає її.

Для створення вигідних бібліотек шляхом клонування рестриктів використовують фермент з короткою (4 п.н.) послідовністю пізнання в умовах, які забезпечують часткову рестрикцію ДНК.

Кожний специфічний сайт-мішень розрізняється цілком випадково, тому присутність сайт-мішені в деякій послідовності не обов’язково призведе до її розриву. Мала ймовірність розрізання по кожному сайту в поєднанні з окремим розташуванням сайтів означає, що розподіл фрагментів забезпечується практично повністю випадковим характером внесення розрізів у геном.

При цьому, кожний фрагмент закінчується одною і тою ж послідовністю, яка може мати “липкий” кінець, тому вигідна для клонування. Число випадкових одержаних фрагментів, які повинні бути клоновані для того, щоб забезпечити високу ймовірність наявності кожної послідовності геному хоч би в одній химерній плазміді, зменшується із зростанням розмірів фрагмента та збільшується зі зростанням розмірів генома і бажаної ймовірності. Для 99% ймовірності необхідно 1500 клонів з фрагментами ДНК Е.соїі; для дріжджів розмір бібліотеки зростає до 4600 клонів; для D. Melanogaster - до 4800 і до 800000 - для ссавців. Всі ці бібліотеки клонованих фрагментів, де досягається така ймовірність присутності послідовностей генома, були одержані. Для здійснення селекції відповідного клона геномної ДНК із бібліотеки застосовують метод гібридизації колоній. Послі-довність операцій цього методу приведена на рис.4.3. Бактеріальні колонії, які несуть химерні вектори, лізують на нітроцелюлозних фільтрах. ДНК денатурують і фіксують на фільтрах. Фільтр гібридизують з радіоактивним зондом. Усі копії, з якими гібридизується зонд, при авторадіографії проявляються у вигляді темних плям. Після цього відповідні химерні вектори можуть бути виділені із бібліотеки.