ГЛАВА 3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИННОГО СТАТУСА
Современные методы определения витаминов в биологических и иных объектах поразделяются на физико-химические и биологические.
При взаимодействии витаминов с рядом химических соединений наблюдаются характерные цветные реакции, интенсивность окраски при которых пропорциональна концентрации данных соединений в исследуемом растворе. Для этих целей можно использовать фотоколориметры, например изменение цвета тиамина регистрируют при помощи диазореактива и т.д. Эти методы позволяют судить как о наличии витаминов, так и о количественном содержании их в исследуемом пищевом продукте или органах и тканях животных и человека. Для выяснения обеспеченности живого организма каким-либо витамином часто определяют соответствующее соединение или продукт его обмена в сыворотке крови, моче или биопсийном материале. Однако эти методы могут быть применены не во всех случаях. Встречаются трудности при подборе специфического реактива для взаимодействия с определенным витамином. Некоторые из них обладают способностью поглощать оптическое излучение только в определенной части спектра. В частности, ретинол имеет специфичную полосу поглощения при 328-330 нм.
Измеряя коэффициент поглощения спектрофотометрически, можно достаточно точно определить количественное содержание витаминов в исследуемом объекте. Однако, спектрофотометрией трудно достоверно оценить величины витаминов в комплексных препаратах, премиксах и кормовых добавках, поэтому прибегают к применению флюориметрической детекции. В частности, при анализе тиамина его переводят в тиохром в щелочной среде, который экстрагируют и затем измеряют интенсивность флюоресценции в сравнении со стандартным раствором. Таким же образом определяют количество пиридоксина по флюоресценции 4-пиридоксиловой кислоты. Кроме того, используются и титриметрические методы, например, для детекции аскорбиновой кислоты применяют титрование раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола. С помощью высокочувствительной дифференциальной вольтамперометрии изучается уровень витамина Е, предварительно окисленного и экстрагированного хлороформом в аппарате Сокслета.
Биологические методы основаны на определении того минимального количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете, лишенной только данного вещества, предохраняет животное от развития гиповитаминоза или излечивает его от уже развившейся болезни. Полученные величины условно принимают за единицу (в литературе известны «голубиные», «крысиные» единицы). Важное место в выяснении насыщенности витаминами биологических жидкостей, в частности крови, занимают микробиологические методы. Подавляющее большинство их основано на ростовых реакциях микробов, скорость которых зависит от наличия витаминов в среде; сравнительно малая часть — на стимуляции основного обмена. И в том, и в другом случае требуется точно знать условия роста и размножения индикаторного штамма: необходимый состав питательной среды, потребность в готовых витаминах и т.д. Поэтому поиск того или иного тест-микроорганизма и разработка самого метода обычно являются практической частью исследований в области физиологии питания, механизма действия витаминов на микробную клетку.
За последние полвека описано и разработано огромное количество микробиологических тестов для определения витаминов группы В, их аналогов и гомологов, микроаминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований. Большую роль в этом направлении сыграла сотрудник Института микробиологии АН СССР Е.Н. Одинцова. Ею были подобраны ауксотрофные тест-культуры дрожжей, в основном из родов Debaryomyces, Pichia, Endomyces, Zygosaccharomyces, разработаны простые питательные среды, построены витаминограммы - графики, показывающие зависимость оптической плотности выращиваемой тест-культуры от концентрации витамина в среде. Кстати, ауксотрофами(от греч. аuхо - выращиваю, увеличиваю и trophe - питание) называются бактерии, грибы или водоросли, утратившие в результате мутаций способность образовывать из более простых веществ-предшественников соединения, необходимые для их роста. Ауксотрофы могут нуждаться в аминокислотах, витаминах или азотистых основаниях и поэтому не растут на питательных средах без добавления этих веществ, в отличие от прототрофов, способных синтезировать все структуры, необходимые для их развития. Созданы достаточно простые способы количественного определения тех витаминов, потребность в которых встречается у ауксотрофных беспигментных форм дрожжей: инозита, биотина, пантотеновой кислоты, тиамина, пиридоксина, никотиновой кислоты. Кроме того, могут быть использованы красные пигментные дрожжи для идентификации присутствия фолиевой и пара-аминобензойной кислот. Данные методы просты и рассчитаны на проведение массовых определений.
Однако большинство рекомендуемых разработок требует для своего воспроизведения наличия сложных синтетических питательных сред. В состав последних обычно входят в качестве дополнительных ингредиентов химически чистые витамины, аминокислоты, факторы роста и ряд других соединений. В настоящее время получили широкое распространение микробиологические тест-комплекты VitaFast® с использованием микротитровального планшета для характеристики насыщенности нутриентами продуктов питания, кормов, фармацевтической и косметической продукции. Результат анализа готов через 5-6 суток.
Одним из точных и простых способов определения витаминов в биологических жидкостях служит твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител против определяемых соединений. Метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и скоростью выполнения. Поскольку витамины - низкомолекулярные соединения и поэтому являются гаптенами (неиммуногенными веществами, но в комплексе с иммуногенами способными вызывать образование антител), для проведения анализа требуется получение конъюгатов с каким-либо белком, чаще бычьим сывороточным альбумином. Кроме того, для осуществления процесса необходимо оборудование: планшеты, шейкеры-инкубаторы, вошеры, ридеры и/или сканеры. Предел обнаружения данного метода составляет 0,5 мкг/мл.
«Золотым стандартом» в количественном и качественном определении витаминов является высокоэффективная жидкостная хроматография. Одно из необходимых условий анализа – это использование дериватизационных технологий для увеличения на порядок чувствительности метода. Компанией «Waters» (США) разработаны и предлагаются на рынке лабораторных услуг способы дериватизации и условия хроматографирования почти всего спектра жиро- и водорастворимых витаминов.
Оценку витаминного статуса можно проводить и физиологическими методами. Например, степень обеспеченности организма ретинолом можно установить, используя показатели темновой адаптации и электроретинограммы. Об уровне насыщения тканей аскорбиновой кислотой судят по результатам «щипковой пробы», которая отражает состояние сосудистой стенки кожных капилляров.
Важнейшим для диагностики дефицита витаминов являются клинические проявления. Чаще всего при недостаточном питании наблюдается сочетание нехватки отдельных нутриентов нередко на фоне энергетической недостаточности, причем клинические признаки дефицита ряда пищевых факторов могут совпадать.
Типичные симптомы и синдромы расстройств питания организма человека приведены в таблице 20.
Таблица 20
| Симптомы | Недостающие нутриенты | Комментарии |
| Волосы: редкие, выпадают прямые, тусклые спирально закрученные Кожа: ксероз петехии пигментация и шелушение фолликулярный гиперкератоз дерматит с болезненным шелушением снижение тургора кожи отечность пурпура (подкожные гемор-рагии) перифолликулярные гемор-рагии бледность склонность к образованию синяков (экхимозов) бледность при надавлива-нии себорейный дерматит дерматит утолщение кожи Глаза: сухая тусклая конъюнктива (ксероз) блефарит офтальмоплегия кератомаляция бляшки Бито васкуляризация роговицы светобоязнь Губы, рот: ангулярные трещины, руб-цы, стоматит хейлоз распухание, пористые, кро-воточащие десны Язык: цвета фуксии ободранный, потрескав-шийся опухший, больших разме-ров ярко-красный | белок, биотин цинк белок витамины А, С незаменимые жирные кислоты витамины А,С ниацин витамин А, возможно незаменимые жирные кислоты белок вода белок, тиамин витамины С, К витамин С фолиевая кисло-та, витамин В12, железо, медь витамины С, К белок + энергети-ческие компонен-ты незаменимые жирные кислоты, пиридоксин, цинк биотин незаменимые жирные кислоты рибофлавин витамины группы В тиамин витамин А витамин А рибофлавин рибофлавин, цинк витамины группы В, железо, рибо-флавин пиридоксин, ниацин, рибофлавин, белок витамин С рибофлавин ниацин ниацин, йод фолиевая кисло-та, витамин В12 | волосы могут выпадать на голове и теле должны быть шелковистыми вызвано изменением фолликулов, нарушением кератинизации, возможно функции сальных желез сухость кожи геморрагии размером с булавочную головку симметрично расположены на открытых для солнечных лучей участках кожи (возможны при гемохрома-тозе) фолликулы забиваются кератином, кожа имеет вид наждачной бумаги запасы жира минимальные, низкие антропометрические показатели связана с белково-энергети-ческой недостаточностью при гипоальбуминемии и дефицитом тиамина при «влажной бери-бери» вызвано повышенной лом-костью капилляров обычно при надавливании на костные выступы также встречается при энтеропатическом акродер-матите с мальабсорбцией цинка; на мошонке и половых губах - при дефиците рибофлавина; на носогубных складках - при дефиците пиридоксина в уголках глаз синдром Вернике, необхо-димо срочное лечение ранний признак дефицита возникают также при непра-вильной подгонке зубных протезов; встречаются пре-имущественно в уголках рта может сочетаться с нарушением обоняния вопрос спорный; цвет фуксии также возможен при общей недостаточности питания вследствие неадекватной ре-парации эпителия языка при недостатке ниацина могут возникать глубокие трещины |
Данными этой таблицы далеко не исчерпываются клинические проявления недостаточности питания.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Д' Адамо П. Четыре группы крови – четыре пути к здоровью/ П. Д' Адамо, К.Уитни (Пер. с англ). – Минск: Попурри, 2001. – 416 с.
2. Агаджанян Н.А. Химические элементы в среде обитания и экологический портрет человека / Н.А.Агаджанян, А.В.Скальный. – М.: Изд-во КМК, 2001. – 83 с.
3. Аноним. Микроэлементы в питании детей первого года жизни // Детский доктор. – 2000. - № 2. – С. 62, 64.
4. Аноним. Об умеренности потребления маргарина // Вопр. питания. – 1998. – № 1. – С. 48.
5. Барочкин К. Учиться надо у улитки / К.Барочкин // «Заб. рабочий». – 15 апреля 2003 г.
6. Бранд-Гарнис Э. Флавоноиды в косметике / Э.Бранд-Гарнис, Х.Бранд // Косметика и медицина. – 2001. - № 5. – С. 22-38.
7. Бутрова С.А. Современная тактика ведения больных / С.А.Бутрова // Лечащий врач. – 2000. - № 5-6. – С. 30-33.
8. Воробьёв В.И. Организация оздоровительного и лечебного питания: 2-е издание, дополненное / В.И.Воробьёв. – М.: «Медицина», 2002. – 446с.
9. Герасимов В.П. Осторожно «хот-дог» / В.П.Герасимов // Свет, природа и человек. – 1998. - № 1. – С. 48.
10. Гигиена питания: учеб.для студ. высш. учеб. заведений / А.А.Королев. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 528 с.
11. Гичёв Ю.П. Всё о наших продуктах для здоровья / Ю.П.Гичёв. -Новосибирск, 2001. – 177 с.
12. Горбачёв В.В. Витамины, микро- и макроэлементы. Справочник / В.В.Горбачёв, В.Н.Горбачёва. – Минск: Книжный дом; Интерпресс-сервис, 2002. – 544 с.
13. Горелова Ж.Ю. Биологически активные добавки к пище: характеристика и перспективы использования / Ж.Ю.Горелова // Вопр. современ. педиатрии. – 2002. – Т. 1, № 5. – С. 86-91.
14. Горшков В.М. Использование плодов основных цитрусовых культур в лечебных целях / В.М.Горшков // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. – 2004. - № 1. – С. 13-16.
15. Грязев В.А. Роль плодов и ягод в диетическом питании человека / В.А.Грязев, Ц.В.Тутберидзе // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. – 2004. - № 1. – С. 6-13.
16. Диетология: Руководство. 2-е изд. / Под ред. А.Ю.Барановского. – СПб: Питер, 2006. – 960 с.
17. Доценко В.А. Лечебно-профилактическое питание / В.А.Доценко // Вопр. питания. – 2001. - № 1. – С. 21-25.
18. Еникеева Н.А. Влияние диеты, обогащенной морскими полиненасыщенными жирными кислотами ω-3 на состояние микроциркуляторного русла у больных кардиореспираторной патологией / Н.А.Еникеева, П.А.Манасова, Е.Д.Костив // Вопр. питания. – 1998. - № 5-6. - С. 39-41.
19. Жвиташвили Ю.Б. Как победить рак - выбор диеты / Ю.Б.Жвиташвили. – СПб.: Нева; М.: Олма-Пресс, 2002. – 320 с.
20. Зайчик А.Ш. Основы патохимии /А.Ш.Зайчик, Л.П.Чурилов. – СПб.: Элби, 2001. – С. 354-403.
21. Коровина Н.А. Витаминно-минеральная недостаточность / Н.А.Коровина // Рос. мед. ж. – 2003. – Т. 11, № 28. – С. 1614-1616.
22. Коровина Н.А. Новый взгляд на витамины группы Д / Н.А.Коровина, И.Н.Захарова, А.В.Чебукин // Рос. мед. ж. – 2000. - Т. 8. – С. 46-50.
23. Ладако К.С. «Рациональное питание детей раннего возраста». – Москва, 2007. – 280 с.
24. Ланкин В.Е. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы / В.Е.Ланкин, А.К.Тихазе, Ю.Н.Беленков// Кардиология. – 2000. - № 7. – С. 48-61.
25. Лечебное питание. Новейший справочник. – СПб: Сова; М.: Издательство Эксмо, 2002. – 896 с.
26. Мазо В. Эссенциальные микроэлементы в питании / В.Мазо, А.Скальный, И.Гмошинский // Врач. – 2003. - № 5. – С. 32-34.
27. Марголина Анна. Фотостарение кожи – профилактика и лечение / Анна Марголина // Косметика и медицина. – 2001. - № 2. – С. 44-53.
28. Маршалкин М.Ф. Пищевые волокна скорцонера и овсяного корня и их лечебно-профилактическое использование / М.Ф.Маршалкин, В.Н.Оробинская // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. – 2004. - № 1. – С.71-74.
29. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия /В.Дж. Маршалл. – СПб.: Невский диалект; М.: Бином, 2000. – 367 с.
30. Махно В.Г. Орехи фундука как средство профилактики болезней старости и фактор активного долголетия / В.Г.Махева. – М.: Колос, 2002. – 220 с.
33. Минделл Эрл. Справочник по витаминам и минеральным веществам / Эрл Минделл (Пер. с англ). – М.: «Медицина и питание», 2000. – 432 с.
34. Мустафина Наталья. Внутренняя инъекция / Наталья Мустафина // Коммерсантъ. Деньги. – 2004. - № 22 (477). – С. 16-17.
35. Неверов И.В. Место антиоксидантов в комплексной терапии больных ИБС И.В.Неверов // Рос. мед. ж. – 2001. – Т. 9, № 18. – С. 767-771.
36. Оганесян Тигран. Кислая жизнь / Тигран Оганесян // Эксперт. – 2001. – № 24. – С. 45-46.
37. Омаров М.Д. Целебные и вкусовые качества плодов хурмы и факторы, определяющие её урожай / М.Д.Омаров, Т.Д.Беседина // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. – 2004. - № 1. – С. 25-28.
38. Погодеева А.В. Пищевые волокна в лечебно-профилактическом питании / А.В.Погодеева // Вопр. питания. – 1998. - № 1. – С. 39-42.
39. Полная энциклопедия здорового питания / Сост. А.В.Маркова. – СПб.: Сова; М.: Изд-во ЭКСМО – ПРЕСС, 2002. – 544 с.
40. Практическое руководство по надзору за организацией питания и здоровьем населения / Под ред. акад. РАЕН проф. В.А.Доценко. – СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2006. – 312с.
41. Регистр лекарственных средств России. – 8-е изд. – М., 2001. – 890 с.
42. Руководство по детскому питанию. / Под ред. В.А.Тутельяна, И.Я. Коня, - М.: Медицинское информационное агенство, 2004, - 662 с.
43. Рутштейн Л.Г. Пеллагра / Л.Г.Рутштейн, Ю.А.Галлямова, В.И.Фадеева // Вестн. последипл. мед. образ. – 2002. - № 3. – С. 58-60.
44. Скальный А.В. Микроэлементозы человека (диагностика, лечение) / А.В.Скальный. – Москва, 1999. – 96 с.
45. Стрейн Дж. Последствия превышения рекомендуемой суточной дозы микронутриентов: фолиевой кислоты и селена / Дж.Стрейн // Вопр. питания. – 2002. - № 3. – С. 50-53.
46. Токсикологическая оценка генетически модифицированных источников (ГМИ) / И.Н.Аксюк, Л.Р.Кравченко, Н.В.Тышко и др. // 2-ой съезд токсикологов России, 10-13 ноября 2003 г.: Тез. докл. – Москва. – 2003. – С. 42-43.
47. Тутберидзе Ц.В. Содержание биологически активных веществ в плодах киви и в продуктах их переработки // Ц.В.Тутберидзе, В.А.Грязев, Т.Л.Троянова // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. – 2004. - № 1. – С. 28-31.
48. Тутельян В.А. Коррекция микронутриентного дефицита – важнейший аспект концепции здорового питания населения России / В.А.Тутельян, В.Б.Спиричев, Л.Н.Шатнюк // Вопр. пит. – 1999. - № 1. – С. 3-11.
49. Филиппенко Н.Г. Влияние рибофлавина на метаболизм витамина В6 у здоровых людей / Н.Г.Филипенко, Л.М.Качмарская, П.Я.Яковлев// Курский науч.-практ. вестник «Человек и его здоровье». – Курск, 2000. – № 6. – С. 101-104.
50. Эллиот В. Биохимия и молекулярная патология / В.Эллиот, Д.Эллиот. -М.: НИИ Биомедицинской химии РАМН; ООО «Материк – альфа», 2000. – 353 с.
51. Эрнандес Е. Витамин А и кожа / Е.Эрнандес // Косметика и медицина. – 2000. - № 5-6. – С. 18-28.
52. Modern nutrition in health and nutrition / ed. Ed.M.Shils, J.A.Olson, M.Shike // Lea G. Fibeger. – 1994. – 891 p.
53. Friedman G.M. Obesity in the new millennium / G.M.Friedman // Nature. – 2000. – 404 (6778). – P. 632-634.
54. Walter P. Towards ensuring the safety of vitamins and minerals / P.Walter // EUROTOX, 2000. – Toxicol. Lett., 2001. – V.120, N.1-3. – P. 83-87.