Исследование патологического материала на вирусные болезни.
В лаборатории полученный патологический материал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть материала берут для вирусологических исследований, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследования присланного материала.
Подготовка органов и тканей для исследования. Вирус необходимо освободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Из растертого материала готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугируют при 1500-3000 оборотов в минуту 15-30 минут, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, пропуская через бактериальные фильтры или обрабатывая антибиотиками широкого спектра действия. Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30-60 минут при комнатной температуре. Затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на питательные среды. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при –20...–70 оС.
Подготовка выделений из носа, глаз для исследования. Тампоны, погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10-15 минут, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют при 2000-3000 оборотов в минуту 20 минут. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500-1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.
Подготовка фекалий для исследования. Пробу кала (приблизительно около 1 грамма) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса или фосфатно-буферного раствора. После гомогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2000-3000 оборотах в минуту в течение 30 минут надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин и стрептомицин по 500-1000 ЕД на 1 мл, нистатин 30 ЕД на 1 мл и 200 мкг тетрациклина на 1 мл. После 30-60 минут контакта производят посев на стерильность, замораживают и хранят при –10...–20 оС. В день заражения исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образовавшегося после замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследования. Исследования кала иногда заменяют ректальными мазками, частота выделения вируса при этом не меньше, а иногда и выше, чем при исследовании кала.
Подготовка крови для исследования. Для выделения вируса используется цельная дефибринированная, «лаковая» кровь (смесь крови с дистиллированной водой 1:1), отдельные элементы крови либо кровь с антикоагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку и добавляют 5-6 капель гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2000-3000 оборотах в минуту в течение 15 минут, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100-200 ЕД на 1 мл, после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2).
Подготовка сывороток для исследования. В сыворотку добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД на 1 мл, проводят высевы на бактериологические среды. Хранят сыворотки в холодильнике при 4оС или в замороженном состоянии.
| Лабораторная диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и вирусной диареи. | ||
| инфекционный ринотрахеит | вирусная диарея | |
| Обнаружения вируса в патологическом материале | РИФ РДП | РИФ |
| Выделение вируса из патологического материала | КК (СЭК, ПЭК, ТБ, ПТ) | КК (СЭК, ПЭК, ТБ) |
| Идентификация вируса | РИФ РН в КК, результат учитывают по ЦПД на 5-7 сутки – округление клеток, отслоение от стекла, разрушение клеток монослоя | РИФ РСК РДП РН в КК, результат учитывают по ЦПД на 5-7 сутки – появляется мелкозернистая инфильтрация, округление, отторжение от стекла, вакуолизация цитоплазмы, иногда штаммы не обладают цитопатическим действием |
| Ретроспективная диагностика | РНГА РДП РН | РСК РН |