Фиксация

При подготовке к фиксации и в процессе ее выполнения необ­ходимо соблюдать некоторые общие правила:

1) подобранный фиксатор должен соответствовать цели иссле­дования; инструменты подбирают заранее (рис.26);

2) объем фиксирующей жидкости должен значительно (в 50-100 раз) превышать объем материала;

3) фиксируют только свежие корни и бутоны, стараясь это де­лать на месте выращивания растений. Чтобы уберечь обнажен­ные корни от действия лучей солнца, лучше проводить фикса­цию в тени;

4) крупные объекты, например корзинки сложноцветных, перед фиксацией разрезают на несколько частей, удаляя ненужные ор­ганы (листья, чашелистики, ости и т. д.), мешающие пропиты­ванию материала. Во время фиксации ножницами отрезают кончики корней длиной 6-7 мм и сразу помещают в фиксирую­щую жидкость. Бутоны чаще фиксируют целиком, колосья пред­варительно разбирают на колоски, но иногда соцветия также фиксируют целиком;

5) время фиксации в течение суток определяют в каждом кон­кретном случае. Корни лучше фиксировать в те часы, когда наблюдается максимум митозов.

Рис. 26. Зонд, ножницы, пинцет, скальпель.

Правильная организация всей подготовительной работы пре­дусматривает некоторую последовательность операций, обеспе­чивающую сравнимость изучаемых вариантов и сокращающую до минимума потери времени на непредусмотренные мероприятия.

Рассмотрим последовательность работы при фиксации корней.

1. Чтобы обеспечить нормальное деление клеток в корнях, вазоны с растениями накануне и за 1-2 ч до фиксации обильно поливают и ставят в теплое место с температурой воздуха 20-25 °С. Чашки Петри с проросшими семенами держат в термостате при температуре 24-25°С. За 1-2 ч до фиксации их также поливают, чтобы корни были свежими.

2. Заранее готовят плоскодонные пробирки или флаконы из-под пенициллина с корковыми пробками и этикетки из плотной бумаги. Пробирки обычно используют с полезным объемом не менее 10 см3. При фиксации колосьев применяют плоскодонные пробирки большего объема, так чтобы в каждую из них можно было поместить несколько колосьев одного варианта. Для этикеток берут белую плотную бумагу. Пергаментная бумага и калька для этих целей не подходят. Размер этикеток 1-1,3х3,5-4 см. На них обычным карандашом аккуратно пи­шут номер фиксации по журналу регистрации фиксаций, дату и час обработки, название объекта (например, «корни Tritictim durum»), сокращенное название фиксатора (Ф. К. - фиксатор Карнуа). Этикетка в пробирке должна соответствовать этикетке в вазоне, в поле или чашке Петри. Особенно важно отметить вариант исследования.

3. В журнале регистрации фиксаций записывают те же сведения об объекте и варианте исследования, которые имеются на этикетке в вазоне, в поле или чашке Петри. Кроме того, указывают цель работы и те данные, которые будут необходимы при обработке результатов научных исследований, например вид специальной обработки корней перед фиксацией, число корней, особенности растения, метеорологические условия и др.

4. Подготовленные чистые пробирки с вложенными в них этикетками раскладывают по вариантам исследования около соответствующих растений или чашек Петри.

5. Непосредственно перед фиксацией готовят смесь Навашина. Для приготовления 1%-ного раствора хромовой кислоты берут 1 г хромового ангидрида и растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до 100 мл. 16%-й раствор формалина готовят так: берут 16 мл 40:%-го (неразведенного) формалина и доводят дистиллированной водой до 40 мл. Перед употреблением смешивают 10 ч. 1%-го раствора хро­мовой кислоты, 4 ч. 16%-го раствора формалина и 1 ч. ледяной уксусной кислоты. В пробирку наливают 7-10 мл готового фиксатора. Устанав­ливают ее вертикально без пробки в специальную подставку или небольшой стаканчик, на дно которого положена вата. Сверив этикетки, начинают фиксировать. Затем пробирки переносят в темное место, чтобы фиксатор не разлагался на свету.

6. Растения из вазонов, перевернув последние вверх дном, осторожно выбивают. При этом растение с комом земли держат в левой руке. Ножницами отрезают кончики молодых корней. Быстро помещают их в фиксатор и погружают в него стеклянной палочкой или встряхиванием пробирки. Зафиксировав достаточное число корней, сосуд с ними нужно поместить на 2-3 мин под колокол воздушного насоса, чтобы избавиться от пузырьков воздуха и облегчить проникновение фиксатора. Можно сделать и так: открытые пробирки с материалом, находящимся в фиксаторе Навашина, поместить в эксикатор, соединенный с водоструйным насосом. Это также ускоряет фиксацию.

Проросшие семена по одному вынимают пинцетом из бак­териологических чашек, отрезают кончики корней и фикси­руют.

Такая же последовательность работы соблюдается при фик­сации эмбриологического материала. В этом случае при необ­ходимости осуществляют кастрацию цветков и опыление.

Эмбриологический материал обычно фиксируют через опре­деленные промежутки времени после нанесения пыльцы на рыльце (так называемая темпоральная фиксация). Для этого со­ставляют график фиксаций в течение одних или нескольких суток, в зависимости от цели исследования. Чтобы ускорить проникновение фиксирующей смеси в крупные объекты, применяют метод вакуум-инфильтрации. Для этого собирают несложную установку, состоящую из эксикатора с краном, вакуумной резиновой трубки, тройника с краном и вакуумного насоса системы Комовского.

Продолжительность обработки зависит от состава фиксато­ра и объекта. Иногда возникает необходимость заменить фик­сатор свежим. Например, фиксатор Навашина в летнее время быстро портится, что легко определить по внешнему виду жид­кости. В этом случае корни или бутоны заливают свежей сме­сью. Хранить материал в фиксаторе можно лишь в отдельных случаях.