Диагностика патогенов в пище.

Главным направлением развития рынка ДНК-диагностики является диагностика инфекционных заболеваний. Если человек страдает заболеванием бактериального или вирусного происхождения, то в его крови обязательно находятся возбудители – бактериальные или вирусные частицы.

Любой возбудитель несет маркерные последовательности ДНК, для которых можно сконструировать праймеры. Таким образом, с помощью ПЦР

можно определить присутствие того или иного микроорганизма в крови, т.е.

поставить диагноз.

В отличие от иммуноферментного анализа, который широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, ДНК-диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания, причем в очень низкой концентрации.

Вот лишь некоторые инфекционные заболевания, которые в настоящее время диагностируются с помощью полимеразной цепной реакции.

 

Вирусные инфекции

1 Цитомегаловирус CMV

2 Вирусы генитального

и простого герпеса HSV1, HSV2

3 Папиллома вирус HPV16, 18

4 Вирус Эпштейна-барр EBV

5 Вирус гепатита B HBV

6 Вирус гепатита C HCV

Бактериальные инфекции

1 Хламидиоз Chlamidia trachomatis

2 Микоплазмоз Mycoplasma hominis

3 Уреаплазмоз Ureaplasma urealyticum

4 Трихомоноз Trichomonas vaginalis

5 Гоноррея Neisseria gonorrhoeae

6 Гарднереллез Gardnerella

7 Язвенная болезнь Helicobacter pylori

8 Дифтерия Токсигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae

9 Коклюш Bordetella pertussis

10 Туберкулез Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis

11 Стрептококковая инфекция Streptococcus pyogenes

12 Кандидомикоз Candida albicans

 

Диагностика рака пока ограничивается небольшим количеством сведений о генах, ассоциированных с этим заболеванием. Для развития успешных методов определения рака необходимы дальнейшие исследования мутаций (в т.ч. в рамках программы «Геном человека»), связанных с канцерогенезом. Вообще название «рак» объединяет большое количество разных заболеваний. В каждом конкретном случае, как правило, неизвестна мутация, приведшая к новообразованию, что существенно затрудняет его диагностику.

Диагностика генетических заболеваний, также как и раковых, может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Однако уже сейчас известны гены некоторых генетиче- ских заболеваний, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона. Гены подобных заболеваний обычно начинают работать в возрасте после 70 лет. Поэтому их ранняя диагностика позволит заранее начать лечение, которое в этом случае может быть более эффективным.

Идентификация личности – одно из самых перспективных направлений на рынке ДНК-диагностикумов. Это очень быстрый и точный метод.

 

СКРИНИНГ БАНКА ГЕНОВ

 

Скрининг –это поиск специфических клонов в библиотеке, которые несут фрагменты ДНК с последовательностями нужного гена: Поиск нужных генов в смеси клонированных фрагментов ДНК библиотеки.

Один путь заключается в поиске специфической последовательности оснований этого гена (если она известна). Другой путь состоит в поиске специфического белка, кодируемого геном. Есть много методов, зависящих от используемого вектора и гена, который предстоит найти.

 

1. Если доступен искомый ген, известно его местоположение, молекулярная масса, то его можно выделить путем разделения фрагментов по молекулярной массе и заряду при помощи гель-электрофореза.

Исследуемые образцы (содержащие различные фрагменты одной и той же ДНК) наносят сверху на агарозный или полиакриламидный (ПААГ) гель. При наложении на гель электрического поля фрагменты начнут переме щаться вниз (от отрицательного к положительному полюсу, поскольку молекулы ДНК отрицательно заряжены) со скоростью, зависящей от длины (массы) фрагмента. Чем меньше размер фрагментов, тем быстрее они движутся. В результате электрофореза в геле образуется ряд полос, расположенных одна под другой. Верхние полосы соответствуют фрагментам, имеющим более крупные размеры, а нижние – более мелкие. Полосы выявляются при окрашивании гелей бромистым этидием и просмотре гелей в ультрафиолетовом свете

Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных молекул с известными молекулярными массами. Зная, какую массу имеет фрагмент, содержащий интересующий нас ген, можно выделить его из электрофоретического геля и использовать по назначению.

 

2. Если известна нуклеотидная последовательность искомого гена, то его поиск в смеси фрагментов ДНК осуществляют с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот (так называемой in situ – гибридизации).

Гибридизация in situ – это отжиг одноцепочечного фрагмента ДНК на комплементарный ему участок другой молекулы ДНК с образованием двухцепочечной гибридной молекулы. Метод предусматривает гибридизацию с ДНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах (т.е. метод гибридизации, не требующий предварительного выделения и очистки ДНК).

Зонды – это искусственно синтезированные меченые (изотопами или флуоресцентными красителями) небольшие (10–30 нуклеотидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК, или ее ДНК-копии), комплементарные искомому гену.

В настоящее время наиболее широко используется FISH (от англ. fluorescent in situ hybridization) — вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченные флуорохромами.

Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНК-зондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек.

1) ДНК-мишень подвергают денатурации тепловой обработкой или щелочью.

2) Полученные одноцепочные ДНК необратимо «пришивают» к твердой подложке (нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр) при высокой температуре.

3) Затем фильтры инкубируют с одноцепочным ДНК-зондом, меченым радиоизотопом или другой меткой. Происходит спаривание комплементарных последовательностей ДНК-мишеней и зондов. Гибридные молекулы обнаруживаются по метке. В качестве нерадиоизотопной метки часто используют биотин, который присоединяют к одному из четырех оснований. На фильтр наносят конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой. Стрептавидин образует комплекс с биотином, который обнаруживается по окраске или люминесценции.

Гибридизация in situ - один из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах.

Применнение:

1) исследование распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК и клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения;

2) определения хромосомной принадлежности и внутрихромосомной локализации уникальных генов,

3) определение взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса.

Гибридизация in situ молекул РНК с кДНК-зондами, проводимая на гистологических препаратах, эффективно используется для анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК.