Геномные библиотеки, клонирование ДНК in vivo.

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить, т.е. клонировать. Цель: получить многочисленные копии желаемых генов. Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды или фаговые ДНК, для крупных – космиды и искусственные хромосомы.

Существует два подхода к клонированию ДНК:

1) использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК.

2) амплификация ДНК in vitro.

Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (библиотека кДНК).

Геномная библиотека (банк генов, клонотека)– это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.

Для создания банка генов необходимо:

1) выделение всей геномной ДНК

2) фрагментация ДНК рестриктазами или ультразвуком

3) Очищенные кольцевые молекулы ДНК (векторы) обрабатывают той же рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК добавляют к плазмидной в присутствии лигаз. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК

4) рекДНК вводят в бактериальные или дрожжевые клетки, где плазмида реплицируется с образованием многих копий.

5) Клонирование бактерий: каждая возникшая колония клеток представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид образует библиотеку геномной ДНК.

Недостаток: фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Достоинство:библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.

Использование:

-источник трансгенов

-источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков

-сохранение генофонда исчезающих видов

Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называются хромосомными библиотеками.