YAC-вектор

Для исследования генов хромосом растений, животных и человека, когда необходимо клонировать фрагменты ДНК в несколько сотен тысяч пн, используются другие векторные системы, примером которой является YAC-вектор (yeast artificial chromosome). Этот вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей. Вектор содержит в себе:

 

1. центромеры, теломеры и последовательность,обеспечивающаяавтономную репликацию);

2. amp^r - для селективной амплификации и маркеры TRP1и URA3 для идентификации клеток, содержащих вектор;

3. сайты рестрикции (EcoRI и BamHI)

 

При подготовке к клонированию YAC– вектор, выделенный в виде плазмиды, расщепляют рестриктазой BamHI, чтобы перевести ее в линейную форму. После этого проводят второе расщепление вектора рестриктазой EcoRI c образованием двух его «плечей», содержащих теломеры. Полученные «плечи» лигируют с крупными фрагментами клонируемой ДНК, полученной путем частичного расщепления высокомолекулярной хромосомной ДНК. Полученные рекДНК трансформируют в клетки дрожжей и трансформанты отбирают на селективной твердой среде. В таком векторе удается осуществить клонирование фрагментов ДНК до 700 тпн. YAC– вектор имеет ряд недостатков, которые частично устранены в векторе BAC (искусственная хромосома бактерий – bacterial artifical chromosome), основу которой составляет плазмида F (половой фактор E. coli). Такой вектор вводят в дрожжи путем электропорации, что повышает эффективность образования трансформантов в 10-100 раз.