ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Фрагменты ДНК, предназначенные для клонирования, получают химическим или ферментативным синтезом, гидролизом рестриктазами и другими эндонуклеазами, дроблением гидродинамическим способом или ультразвуком. Изменяя условия, можно получить фрагменты разной длины, но в ряде случаев фрагменты ДНК перед клонированием фракционируют по размеру. Образующиеся двунитевые фрагменты ДНК обладают разными концами, что определяет выбор метода их присоединения к векторным молекулам. Если фрагменты синтезированы или получены воздействием рестриктаз, концы их могут быть тупыми или липкими. Фрагменты, полученные в результате неспецифического дробления ДНК, имеют на концах случайные однонитевые участки. При этом разрывы распределяются по молекулам случайно, так, что среди образовавшихся фрагментов всегда содержится любой из генов в неповрежденном виде. Расщепление ДНК рестриктазами носит неслучайный характер. Если в клонируемом гене имеется сайт узнавания используемой рестриктазы, то ведут ограниченный гидролиз ДНК, чтобы не разрушить этот ген.
1. Выделение природных генов с помощью рестриктаз,которые вызывают гидролиз ДНК с образованием липких концов.
Рестриктазы действуют на ДНК любых организмов, если в ней есть распознаваемые сайты – палиндромные участки. В ГИ используется более 500 рестриктаз, способных разрезать ДНК в 120 местах.
Недостатки: не всегда можно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, в котором содержится нужный ген;
В составе вырезанного фрагмента ДНК могут оказаться интроны и рекДНК не смогут экспрессироваться в прокариотических клетках из-за отсутствия способности к процессингу и сплайсингу.
Химико-ферментативных синтез генов
Ему предшествует секвенирование –расшифровка нуклеотидной последовательности. Синтезируют короткие (8-16 пн) одноцепочечные фрагменты ДНК, затем их соединяют с помощью лигаз и отжигают, т.е. дают возможность образоваться двухнитевым молекулам ДНК.
Ферментативный синтез генов
Выделяют мРНК и на ней, с помощью ревертазы синтезируют нить ДНК. Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регуляторной части и промотора, т.е. не могут функционировать в клетках. При переносе в бактерию, к структурным генам присоединяют промотор оперона, и ген начинает работать.