По цветной реакции Яффе (метод Поппера с соавт.)

Принцип метода. При взаимодействии креатинина с пикриновой кислотой в щелочной среде образуется соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации креатинина.

Реактивы

1. Насыщенный раствор пикриновой кислоты. 2 г пикриновой кислоты растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды. Раствор оставляют на сутки, после чего фильтруют.

2. Основной стандартный раствор креатинина, 8,80 ммоль/л. 100 мг креатинина растворяют в 100 мл 0,1 н раствора соляной кислоты.

3. Раствор едкого натра, 100 г/л.

4. 0,1 н раствор соляной кислоты.

Ход определения концентрации креатинина в сыворотке крови.

1 мл сыворотки крови смешивают в пробирке с 3 мл прозрачного насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин её помещают на 15-20 с в кипящую водяную баню, затем центрифугируют.

К 2 мл центрифугата добавляют 0,1 мл раствора NаОН и содержимое пробирки тщательно перемешивают. Ещё раз центрифугируют и доводят дистиллированной водой до объёма 5 мл.

Через 10 мин пробы колориметрируют при зелёном светофильтре (длина волны – 530 нм) в кювете шириной слоя 10 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольных проб.

Контрольную пробу готовят следующим образом. К 1,5 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты добавляют 0,1 мл раствора NаОН и доводят объём дистиллированной водой до 5 мл.

Стандартную пробу обрабатывают так же, как и опытную, с той разницей, что вместо сыворотки берут 1 мл рабочего стандартного раствора. Содержимое пробирки не центрифугируют.

Расчитывают концентрацию креатинина по формуле:

Х = А_оп : А_ст · 88,

где Х – содержание креатинина в сыворотке крови (мкмоль/л),

А_оп – абсорбция опытных проб,

А_ст – абсорбция стандартных проб (за вычетом значений абсорбции контрольных проб),

88 – концентрация креатинина в стандартном растворе (мкмоль/л).

Содержание креатинина в сыворотке крови здоровых людей: у женщин – 44-97 мкмоль/л; у мужчин – 53-106 мкмоль/л; у новорождённых – 27-28 мкмоль/л; у детей до 1 года – 18-35 мкмоль/л; у детей старше года – 27-62 мкмоль/л; у подростков – 44-88 мкмоль/л.

Ход определения содержания креатинина в моче. В мерной колбе объёмом 100 мл смешивают 0,5 мл мочи (из суточного количества) с 3 мл раствора пикриновой кислоты. Смесь тщательно встряхивают и добавляют к ней 0,2 мл раствора едкого натра. Выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин, доводят дистиллированной водой до объёма 100 мл. Абсорбцию измеряют на ФЭКе в кювете толщиной слоя 10 мм при зелёном светофильтре. Результаты сравнивают с данными контрольных проб.

Контрольные пробы готовят следующим образом. К 3 мл раствора пикриновой кислоты добавляют 0,2 мл раствора NаОН, объём смеси доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Для получения стандартной пробы к 0,5 мл основного стандартного раствора, содержащего 0,5 мг креатинина, приливают 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл раствора едкого натра. Далее пробы обрабатывают так же, как и опытные.

Содержание креатинина рассчитывают по формуле:

Х = А_оп : А_ст · 8,80, где

Х – цифры креатинина в моче (ммоль/л),

А_оп – абсорбция опытной пробы,

А_ст – абсорбция стандартной пробы,

8,80 (ммоль/л) – концентрация основного стандартного раствора креатинина.

Суммарное количество выделенного креатинина у здоровых мужчин составляет 8,8-17,6 ммоль/сут, т.е. 1,0-2,0 г/сут, а у женщин – 7,4-15,0 ммоль/сут, т.е. 0,8-1,5 г/сут.