Лабораторная работа 2-3

1. Получают гепаринизированную периферическую венозную кровь (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в объеме 5 мл.

2. Лейкоциты выделяют из периферической крови. Для этого добавляют в пробирку 0,3% раствор желатины, перемешивают и инкубируют в термостате 30 мин при 37 °С для осаждения эритроцитов. Собирают лейкомассу. Клетки отмывают полной культуральной средой, центрифугируя при 1000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру отмывки проводят дважды.

3. К клеточному осадку добавляют 50 мкл полной культуральной среды. Затем в каждую пробирку вносят по 50 мкл предварительно разведенного образца нужных моноклональных антител (монАТ), меченных флуорохромами. Одна пробирка (контроль) содержит только клетки и полную культуральную среду.В остальные пробирки добавляют монАТ - CD3, CD4, CD8, CD19 и другие в зависимости от цели эксперимента.

4. Пробирки инкубируют 30 мин при 4 °С.

5. Клетки отмывают от излишних монАТ в полной культуральной среде центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.

6. Оставшиеся в пробе эритроциты лизируют, добавляя к клеточному осадку лизирующий раствор, состоящий из 0,8% раствора NH₄Cl, 0,1% раствора NaHCO₃, 0,0037% натриевой соли ЭДТА (рН = 7,2-7,4).

7. Проводят встряхивание проб на шейкере 1 мин.

8. Образцы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, добавляют полную культуральную среду и повторяют центрифугирование в том же режиме.

9. Для фиксации меченых клеток в каждую пробу добавляют по 100 мкл 2% параформальдегида и инкубируют 30 мин при 4 °С.

10. Анализ образцов проводят на проточном цитометре. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови здоровых людей представлено в табл. 2.2.