Практическая работа №2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕРА (ФЭК).

Ход работы. Определение гемоглобина в крови традиционно проводится на основе измерения окра­шенного железопорфиринового комплекса. При этом используются разные фотометричес­кие методы: цианметгемоглобиновый метод Драбкина, аммиачный метод и другие. Принцип этих методов заключается в подготовке из цельной крови с помощью трансфор­мирующих растворов биопроб с последующим их фотометрированием.

Гемиглобинцианидный метод (метод Драбкина). В этом методе Fe+² гемоглобина окисляется до Fe+³метгемоглобина, который затем переводится в стабильный цианметгемоглобин (CNmetHb). Абсорбция CNmetHb измеряется при 540 нм, при которой имеется максимум абсорбции. Этот метод характеризуется высокой точностью, простотой исполнения, дешевизной и возможностью выполнения на гема­тологических анализаторах. Для гемиглобинцианида фактор пересчета коэффициента оптической плотности в концентрацию гемоглобина является известной величиной и равен 367.7(Х=540 нм). Расчет проводится по следующей формуле:

Нв(г/л) = 367,7 х А _540нм

 

где A_540нм - абсорбция раствора гемоглобина при длине волны 540 нм.

 

Ход определения. В пробирку с 5 мл трансформирую­щего раствора добавляют 20 мкл крови (капилляр Сали, разведение 1:251). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин. Измерения проводят на спектро­фотометре при длине волны 540 нм или на фотоэлектроколориметре при длине волны 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм против холостой пробы (трансформирующий раствор.).

При использовании спектрофотометра с точной величиной длины волны (540 нм), расчет проводят по указанной выше формуле. При использовании ФЭК и зеленого светофильтра расчёт содержания гемоглобина производят по специальному калибровочному графику, который строится отдельно для каждого фотометра.

Аммиачный метод (модифицированный метод Дервиза-Воробьева). Сущность ме­тода заключается в том, что все разновидности гемоглобина не переводятся в единую форму, а выполняется разведение пробы крови (различных производных гемоглобина) в 0,04% растворе аммиака. Для модифицированного метода Дервиза-Воробьева оптимальной (рабочей) полосой пропускания является точка 523 нм, при которой сводятся к минимуму ошибки измерения. В данной точке два производных гемоглобина - оксигемоглобин и метгемоглобин имеют одинаковое поглощение, поэтому результат фотометрирования не зависит от относительного содержания этих производных в растворе. Перед работой строится калибровочная кривая, по которой после фотометрирования расчитывают концентрацию Нв.

Этот метод реализован в гемоглобиномет­ре "МиниГЕМ-523" , имеющем узкополос­ный светофильтр с максимумом пропускания на длине волны 523 нм. Методическая точность опре­деления гемоглобина на гемоглобинометрах "Ми-ниГЕМ-523"(предельно допустимое значение коэф­фициента обшей аналитической вариации) не пре­вышает 1,5%, если концентрация карбоксигемоглобина в крови не превышает 10%.