Иммобилизованных ферментов

Преимущество иммобилизованных ферментов позволило создать новые промышленные технологические процессы. Ниже указано применение их в лёгкой и химической промышленности, производстве пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

Широкое применение иммобилизованных ферментов следует отметить в области химической промышленности:

1. Добавление ферментов в стиральные порошки позволяет удалять застарелые, а также масляные и жировые пятна.

2. С помощью иммобилизованных ферментов со шкур удаляют волосяной покров и смягчают кожу после дубления

3. Из обрезков шкур с помощью иммобилизованных ферментов извлекают шерсть, которая используется для производства тканей.

4. Иммобилизованные ферменты участвуют в получении из перекиси водорода кислорода, который необходим для превращения латекса в губчатую резину.

В пищевой промышленности следует отметить процессы:

1. Осветления фруктовых соков с помощью иммобилизованных ферментов.

2. В результате ферментативного гидролиза целлюлозы получается глюкоза, которая используется в пищу человека и добавляется в корм животным.

3. Получение глюкозофруктозных сиропов.Фруктоза (фруктовый или медовый сахар) – важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Превращаясь в печени и кишечнике животных в глюкозу, фруктоза включается в пластический и энергетический обмен клетки. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза менее калорийный пищевой продукт по сравнению с последним.

4. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фруктовый сахар может потребляться больными диабетом. 5. Фруктоза не вызывает кариеса зубов. 6. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производства кондитерских изделий.

Объём производства фруктозы за последние 100 лет вырос в 15 раз и составляет, по разным оценкам, 30-40 кг в год на человека. Однако, несмотря на явные преимущества использования фруктозы, первая промышленная установка для превращения глюкозы в фруктозу с помощью иммобилизированной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 году (компания «Клинтон Корн», США). Исходным сырьём для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для конструирования промышленного биокатализатора глюкоизомеразу сорбируют.

Коммерческие препараты иммобилизированной глюкоизомеразы, имеют вид гранул, шариков, волокон или аморфной массы. Наиболее эффективными биореакторами для получения фруктозы признаны реакторы колонного типа высотой 5 м, в которых по сравнению с реакторами перемешивания расход фермента минимален. Производительность такого реактора варьирует от 600 до 9000 кг глюкозофруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованного фермента в зависимости от чистоты исходного сырья. А время полуинактивации катализатора 20-50 суток. Полученный в результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42-45% фруктозы, 51% глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы.

Эти смеси постепенно вытесняют инвертированный сахар в промышленности и медицине. Глюкофруктозную смесь широко применяют для производства тонизирующих напитков, консервированных фруктов, кондитерских изделий, хлеба, мороженного. Экономические расчёты показали, что производство глюкозофруктозных сиропов с использованием иммобилизованной глюкозоизомеразы в 1,5 раза выгоднее получения сахарозы из сахарной свеклы по традиционной технологии. Благодаря этому обстоятельству производство глюкофруктозных сиропов в мире постоянно растёт. Так, в 1990 году 10% потребляемого населением Японии сахара заменено на глюкозофруктозную смесь. В США эта доля в настоящее время достигла 40%.

Получениe L-аспарагиновой кислоты. Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химическим путём фумарата аммония была запущена в 1973 году в Японии (фирма «Танабе Сейяку»); в ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки E. Coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу.

Полиакриламидный гель с иммобилизованными микробными клетками фасуют в виде кубиков размером 2-3 мм, которыми заполняют колонку объёмом 1м³. Через колонку пропускают раствор фумарата аммония. При подкислении выходящего из колонки элюата до рН 2,8 и охлаждении до 15°С из него выкристаллизовывается аспарагиновая кислота в виде препарата 100% чистоты. Процесс получения аспартата полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Производительность процесса – 1700 кг чистой аспарагиновой кислоты в сутки на реактор.

Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность фермента на 80% в течение 120 дней и на 50% в течение 600 дней работы реактора, в то время как свободные клетки - всего на протяжении 10 дней с уровнем активности 25% от исходной. В Армении налажен промышленный процесс получения аспартата особой степени чистоты с использованноием иммобилизованной аспартат-аммиак-лиазы на базе научных разработок МГУ им. Ломоносова (1994).

Получение L-аминопенициллановой кислоты.6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) – ценное исходное соединение для получения эффективных синтетических аналогов природных пенициллинов. Получение 6-АПК в промышленности путём химического гидролиза бензилпенициллина сопряжено с большими трудностями в связи с крайней неустойчивостью лактамного цикла его молекулы. Так, при щелочном гидролизе бензилпенициллина выход 6-АПК составляет всего 1%. Продуктивность этого процесса удалось значительно повысить благодаря применению для гидролиза иммобилизованных бактериальных клеток, содержащих пенициллинамидазу.

Со второй половины 70-х годов 20 века вся 6-АПК, выпускаемая в России, и значительная часть 6-АПК, получаемая в Италии, производятся с помощью иммобилизованных ферментов. На итальянских фирмах применяют фермент, иммобилизованный включением клеток E. Coli в волокна триацетата целлюлозы, а на российских предприятиях используют бактериальные клетки, иммобилизованные в полиакриламидном геле. Переход к технологии, применяющей иммобилизованные бактериальные клетки, обеспечивает высокий выход 6-АПК, составляющий 80-85%. По данным японских исследователей, время полуинактивации пенициллинами-дазы, содержащейся в иммобилизованных в полиакриламидном геле бактериальных клетках, равно 42 суткам при 30°С или 17 суткам при 40°С.

Ферментативная конверсия целлюлозы в глюкозу.

В связи со значительным исчерпанием углеводородного сырья насущной проблемой для дальнейшего развития биотехнологии становится освоение новых сырьевых источников. По существу неисчерпаемый и одновременно возобновляемый источник сырья представляет собой растительная биомасса (многолетние растения, вторичные продукты и отходы их промышленной и сельскохозяйственной переработки), основным компонентом которой служит целлюлоза (клетчатка). Ежегодно на земле создаётся около 100 млрд. т целлюлозы.

Благодаря плотной упаковке линейно построенных полигликозидных цепей целлюлоза устойчива к действию большинства растворителей и химических агентов, в том числе сильных кислот. В природе существуют целлюлолитические организмы (бактерии, плесневые грибы) и некоторые виды насекомых, содержащие полиферментные комплексы целлюлаз, обеспечивающие гидролиз клетчатки до глюкозы. Целлюлазный комплекс ферментов включает эндо-1,4-β-глюканазу, целлобиазы, механизм действия которых на клетчатку одинаков для всех исследованных целлюлазных комплексов независимо от их происхождения. Попадая на целлюлозосодержащие материалы, микроорганизмы выделяют целлюлазы, которые, сорбируясь (иммобилизируясь) на субстрате, постепенно расщепляют его до глюкозы.

В последние годы разработана технология для непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозы на уровне опытных установок. Процесс протекает в противоточных реакторах колонного типа, плотно заполненных целлюлозой. Расчёты показывают, что перевод процесса на промышленный уровень обеспечивает получение 24 тонн глюкозы в сутки. Дальнейшее совершенствование эффективности метода конверсии целлюлозосодержащего сырья в глюкозу и далее в этанол и углеводороды позволит создать альтернативные пути получения ценных моносахаридов и жидкого топлива из возобновляемого сырья, а также решить ещё одну важную проблему – утилизацию экологически опасных отходов производства.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов.

Высокая эффективность биологических катализаторов и специфичность их действия делают ферменты идеальными реагентами для аналитической химии. Благодаря этим особенностям с помощью ферментов обнаруживаются вещества при предельно низкой концентрации в присутствии множества других соединений. К настоящему времени созданы искусственные аналитические системы различных конструкций (биосенсоры, датчики, ферментные электроды, проточные анализаторы), содержащие иммобилизованные ферменты и клетки предназначенные для автоматического детектирования продуктов энзиматического превращения. Например, если использовать иммобилизованную глюкозооксидазу, то концентрацию окисляемой кислородом глюкозы определяют, регистрируя количество выделившегося в ходе реакции пероксида водорода.

Разработаны новые поколения биодатчиков на основе полупроводниковых структур и мезоэлектрического эффекта. Они дают возможность создавать сенсоры, чувствительные к газам, что имеет существенное значение для создания роботов, реагирующих на изменения внешних воздействий.

Технологические варианты реакторов с иммобилизованными ферментами весьма разнообразны – колонки, трубки, полые волокна. С их помощью на практике определяют концентрацию широкого спектра соединений – глюкозы, аминокислот, мочевины, пенициллина, АТФ, стероидов, желчных кислот. Американскими учёными (J. Aylott, R. Kopelman, 2000), сконструирован микродатчик, работающий на основе глюкозооксидазы и рутениевого красителя, иммобилизованных в полиакриламидной матрице на основе субмикронных оптических волокон. Микробиосенсор, не вызывая повреждений, может быть введён в клетку для измерения содержания в ней глюкозы и кислорода.

Разработаны датчики на основе иммунодетекции для проведения экспресс – анализов на присутствие производных диоксина (А. Nomura еt al.,2003) и оценки содержания биогенных аминов в пищевых продуктах в связи с процессами их старения. Для определения мочевины ферментным электродом требуется всего 30 секунд.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов помогают выполнять десятки быстрых и точных анализов при диагностике заболеваний, контролировать содержание вредных веществ (инсектицидов, пестицидов, удобрений) в пищевых продуктах и в воздухе. Биосенсоры нашли применение в решении аналитических задач в сельском хозяйстве, химической и микробиологической промышленности.

Ферменты в пищевой (молочной) промышленности.

У каждого народа имеется хотя бы одно национальное блюдо, приготовленное путём брожения. В Армении и Грузии широко применяют мацони, в Болгарии и Беларуси популярен кефир, во Франции и Испании – сыры типа Рокфор, русская и украинская кухня немыслимы без ржаного хлеба и простокваши. Из национальных блюд эти продукты превратились в общепризнанные, интернациональные.

Ещё И. И. Мечников в конце 19 века обратил внимание на важность нормальной деятельности кишечной микрофлоры и в случае нарушения – необходимость её восстановления с помощью молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus, предотвращающих развитие чужеродных микробов. Чистые культуры этих бактерий используют для получения ацидофилина. Его изготовляют из стерильного молока (стерилизация 15 мин при 120°С или 30 мин при 110°С), добавляя чистую посевную культуру и выдерживая 20-48 часов при температуре 35-37°С до получения продукта требуемой кислотности. Количество живых бактерий Lactobacillus acidophilus в ацидофилине должно быть не менее 200 млн. в 1 мл. Содержание молочной кислоты в хорошо приготовленном ацидофилине 0,65-0,75%. Во время брожения ацидофильные бактерии синтезируют органические кислоты (в основном молочную), ассимилируя глюкозу, галактозу, лактозу и другие сахара.

Популярным молочнокислым продуктом можно считать кефир. В глубокой древности для приготовления кефира кобылье, козье, овечье или коровье молоко засевали так называемыми «кефирными зёрнами». Это была естественная симбиотическая микрофлора, включающая молочнокислые бактерии Lactobacillus casei, дрожжи Saccharomyces kefir и некоторые виды сопутствующих стрептококков. Молоко сбраживалось в курдюках; в результате выделения диоксида углерода напиток становился шипучим. Современный кефир в основном готовят путём заквашивания коровьего молока.

Микрофлора другого молочнокислого продукта – йогурта – смешанная, но доминирует болгарская палочка Lactobacillus bulgaricus, сбраживающая глюкозу, галактозу и лактозу.

Кумыс получают из кобыльего молока с помощью молочно – кислых бактерий (Lactobacillus casei), стрептококков и дрожжей, сбраживающих лактозу.

Приготовление сыра. Сыр готовят из творога, полученного в результате свёртывания казеина цельного или обезжиренного молока. Свёртывание казеина происходит под влиянием микробных ферментов и молочной кислоты или при помощи сычужного фермента. В свёртывании принимают участие молочнокислые бактерии Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis. В результате свёртывания белка кальций отделяется от казеина, последний выпадает в осадок в виде хлопьев водонерастворимой казеиновой кислоты.

Для изготовления различных видов сыра используют овечье, козье, коровье или кобылье молоко. В зависимости от технологии сыроварения сыворотку полностью или частично отделяют от творога на фильтр-прессе. Творог засевают культурами микроорганизмов в соответствии с сортом получаемого сыра. При его созревании под влиянием выделяемых микроорганизмами ферментов химический состав и физические свойства творога существенно меняются. Острый привкус сыра Рокфор обусловлен действием микробной липазы – фермента, расщепляющего жиры молока с образованием жирных кислот (капроновой, каприловой, каприновой).

Созревание сыра длится от нескольких недель до нескольких месяцев (для сыра Чеддер – 8 мес.). В первые недели созревания число микроорганизмов в массе сыра увеличивается и достигает нескольких сотен миллионов в 1 г массы сыра, потом число живых бактерий и дрожжей снижается. Сыр должен созревать при пониженной температуре (для сыра Рокфор - не выше 9°С).

В молочной промышленности широко используют ферменты в целях повышения качества продукции и расширения ассортимента. Для коагуляции белков при изготовлении сыра применяют сычужный фермент реннин (гемозин), получаемый из желудка (сычуга) молодых телят. В настоящее время более 500 сортов сыра изготовляют с применением реннина (гемозиновые сорта). Он является эффективным сгустителем казеина и расщепляет минимальное количество молочных белков до водорастворимых компонентов.

Чтобы удовлетворить спрос на реннин, разработано несколько способов получения аналогичного фермента микробного происхождения. Ещё в 20-е годы было предложено использовать в сыроварении протеазы плесневого гриба рода Mucor, однако предложенные грибы оказались непригодными, главным образом из-за синтеза неприемлемых побочных продуктов. В 80-е годы было выделено два термофильных штамма мукоральных грибов Mucor pusilus и Mucor miehei, синтезирующих подходящие ферменты, хотя оказалось, что микробный ренин имеет более высокую по сравнению с животным протеолитическую активность. Хорошими сгустителями являются также протеазы других микроорганизмов (Pseudomonas mixoides, Bacillus licheniformis). В настоящее время в сыроварении используют около 10% реннина микробного происхождения. Получены результаты по успешной трансплантации в клетки бактерий гена, отвечающего за синтез ренина в организме животных, что существенно увеличивает возможности использования микробного реннина.

В молочной промышленности применяют каталазу, использование которой совместно с пероксидом водорода позволяет исключить процесс пастеризации, проводимой с целью инактивации патогенной и посторонней микрофлоры. В результате пастеризации теряются естественные ферменты молока. Пероксид водорода в концентрации 0,2-0,3% от объёма молока выполняет функции дезинфектора, существенно не влияя на ферменты молока (липазу, протеазу, фосфатазу). Добавки каталазы инактивируют остатки пероксида водорода в молоке.

При производстве 1 тонны сыра образуется 9 тонн сыворотки и пахты. В каждой тонне сыворотки содержится около 5 кг высококачественного белка, витамины группы В, комплекс свободных аминокислот, все важнейшие минеральные элементы, в том числе фосфор и кальций. Но главной ценностью сыворотки является лактоза (молочный сахар).В 1 тонне сыворотки содержится около 50 кг молочного сахара – ценнейшего сырья для пищевой и микробиологической промышленности. Лактоза имеет низкую сладость, но при действии на неё лактазы расщепляется на два моносахарида – глюкозу и галактозу.

Разработано несколько биотехнологических приёмов для рационального использования сыворотки и пахты: На вторичном молочном сырье можно выращивать культуры кормовых дрожжей, обладающих лактозной активностью (Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis). Из этих дрожжей можно выделить лактозу.

Весьма эффективным является выделение из депротеинизированной сыворотки сахаров путём биогидролиза молочного сахара с помощью иммобилизованной лактазы. Степень конверсии молочного сахара составляет 80%. Продукты гидролиза (глюкоза и гагактоза) успешно применяют в разных отраслях пищевой промышленности, например для приготовления мороженного. Добавление этих сахаров в мороженное препятствует кристаллизации сахаров, и его можно сохранять длительное время (до 4 мес.).

 

Иммобилизованные ферменты в медицине.

Иммобилизированные ферменты имеют огромное значение для медицины. В частности, большой рынок сбыта занимают тромболитические ферменты, предназначенные для борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Так, в отечественную клиническую практику внедрён препарат «стрептодеказа», содержащий стрептокиназу – предшественника плазмина, предотвращающий образование тромба в кровеносной системе. Для растворения тромбов в кровеносных сосудах используют иммобилизованную стрептокиназу (рис. 10.7).

Также используют фермент в качестве лечебного препарата в том случае, когда из-за отсутствия собственного эндогенного фермента организм не может сам избавиться от токсических веществ. Введенный в обычном растворимом виде он даёт положительный результат, тогда как все другие ферменты неустойчивы и вызывают аллергическую реакцию. Таким образом, иммобилизация повышает стабильность фермента, а также препятствует его взаимодействию с иммунной системой организма.

 

Рис. 10.7. Схема воздействия стрептокиназы